Identification of effectors of Hemileia vastatrix that suppress the immunity activated by conserved molecular patterns of pathogens in Nicotiana benthamiana

Durante a interação com as plantas hospedeiras, os fungos causadores de ferrugens secretam e translocam diversas proteínas efetoras para o citoplasma das células vegetais, onde atuam suprimindo as respostas de defesa e promovendo o parasitismo. Em estudos prévios foram identificados genes candidatos a efetores em Hemileia vastatrix (HvECs) que codificam proteínas secretadas com funções desconhecidas. Visando entender o papel dessas proteínas secretadas na patogênese da ferrugem do cafeeiro, o presente trabalho teve como objetivo o estudo funcional de 54 candidatos a efetores do isolado monopostular de H. vastatrix HV-01 (raça II), avaliando-se a sua capacidade de suprimir a imunidade ativada por padrões moleculares conservados (PAMPs) da bactéria não patogênica Pseudomonas fluorescens em Nicotiana benthamiana. Essa resposta de imunidade, denominada PTI (PAMP-Triggered Imunnity), é a primeira linha de defesa induzida que as plantas utilizam para resistir ao ataque de patógenos. As sequências dos 54 genes que codificam as potenciais proteínas efetoras foram clonadas individualmente no vetor de expressão pEDV6 (Effector Delivery Vector) e os plasmídeos recombinantes foram transferidos para P. fluorescens EtHAn (Effector to Host Analyser) (Pf EtHan), que possui um sistema de secreção tipo III (SST3) capaz de translocar as proteínas codificadas pelos genes candidatos para o citoplasma de N. benthamiana. Desesseis proteínas efetoras apresentaram capacidade de suprimir PTI com alta reprodutibilidade em diferentes experimentos de co-infiltração de Pf EtHAn com a bactéria patogênica P. syringae pv. tomato DC3000 em N. benthamiana. A supressão de PTI por um gene candidato (HvEC_064) foi confirmada analisando-se o crescimento populacional de Pst DC3000 e morte celular nos tecidos infiltrados onde ocorreu, ou não, a supressão de PTI e ativação de imunidade desencadeada pelo reconhecimento de efetores dessa bactéria. Pode-se postular, com base nesses estudos, que os efetores de H. vastatrix com atividade supressora de PTI em N. benthamiana são prováveis efetores citoplasmáticos. Esses efetores serão priorizados em estudos futuros visando a identificação de genes de avirulência desse fungo e dos seus alvos nas células do cafeeiro.During the interaction with host plants, rust fungi secrete and translocate several effector proteins into the cytoplasm of plant cells to suppress defence responses and promote parasitism. Previous studies have identified genes in Hemileia vastatrix that encode effectors with unknown functions. In order to understand the role of these effectors in the pathogenesis of coffee rust, this study aimed the functional analysis of 54 candidate effectors from the monopustular isolate of Hemileia vastatrix HV 01 (race II), by evaluating their ability to suppress Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) responses triggered by the nonpathogenic bacteria Pseudomonas fluorescens in Nicotiana benthamiana. This immune response, known as PTI (PAMP-Triggered Immunity), is the first line of induced defenses used by plants to resist pathogen attack. Gene sequences encoding the 54 putative effectors were individually cloned into pEDV6 (Effector Delivery Vector) vector. The recombinant plasmids were transferred to P. fluorescens EtHAn (Effector to Host Analyser) (Pf EtHan), which has a type III secretion system (T3SS) able to translocate the proteins encoded by the candidate genes into the cytoplasm of N. benthamiana. Sixteen candidate effector genes suppressed PTI with high reproducibility in different co-infiltration experiments of Pf EtHAn with the pathogenic bacterium P. syringae pv. tomato DC3000 in N. benthamiana. The suppression of PTI by a candidate gene (HvEC_064) was confirmed by analysing Pst DC3000 population growth and cell death in the infiltrated tissues where PTI was suppressed. The effectors of H. vastatrix with suppressive activity of PTI identified are likely cytoplasmic effectors. These effectors will be further investigated in future studies aimed to identify avirulence genes of this fungus and its targets in coffee plant cells.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio