Genetic diversity analysis of Cowpea mild mottle virus isolates in conventional and transgenic common bean cultivars resistant to Bean golden mosaic virus

A cultura do feijoeiro comum no Brasil, além do imenso valor que representa na cadeia econômica e para milhares de agricultores no país, é fundamental devido à contribuição que possui na segurança alimentar da população. Cultivares com evento de resistência ao Bean golden mosaic virus (begomovirus), vírus responsável por causar uma das doenças que mais afeta a produtividade da cultura no país, foram desenvolvidas após vários anos de pesquisas. Infecções durante testes em campo desses materiais por outro vírus, o Cowpea mild mottle virus (carlavirus), gerou novas preocupações tanto aos pesquisadores envolvidos no projeto do feijoeiro resistente ao mosaico dourado quanto aos produtores que aguardavam a liberação comercial dessas cultivares. Apesar de alguns trabalhos já terem sido desenvolvidos a fim de se avaliar os prejuízos produtivos que o CPMMV causa sobre as isolinhas transgênicas de feijoeiro, assim como sua distribuição, nenhum conhecimento se tem sobre a diversidade desse vírus em feijão comum ou transgênico no Brasil, e poucos trabalhos dessa natureza são encontrados na literatura até hoje. Nesse trabalho, buscou-se avaliar a variabilidade de populações do CPMMV para cada uma de quinze cultivares de feijoeiro comum, sendo dez transgênicas (resistentes ao BGMV) e cinco convencionais, em um campo experimental com ocorrência e transmissão natural do CPMMV. Também foram quantificados os níveis virais em cada cultivar a partir de três repetições. Para cada uma das quinze plantas representando 15 diferentes genótipos de feijoeiro comum, o genoma completo de cinco isolados de CPMMV foi sequenciado pela montagem de sequenciamentos de blocos de PCR. Diferenças foram encontradas na variabilidade dos cinco isolados de CPMMV em plantas transgênicas e em plantas convencionais. Os valores dos descritores de variabilidade π, S, K e Θ foram geralmente maiores nos grupos de isolados de plantas transgênicas. Isso se repetiu para todas as ORF’s virais analisadas. As ORF’s 2, 3 e 4 foram as que tiveram a maior diversidade registrada, enquanto que a diferenças entre os grupos já citados foi mais perceptível nas regiões das ORF’s 2, 5 e 6. Eventos de recombinação foram encontrados na ORF 1 viral, quase sempre ocorrendo em isolados de plantas transgênicas, assim como alguns na ORF 2 e 6. Analisando as sequencias da ORF 1, nota-se que os cinco isolados de cada planta se agrupam e tendem a formar clados próximos a grupos de isolados de genótipos hospedeiros similares, o que pode decorrer da interação entre a replicase viral e a planta. Para a região 3’ do genoma, houve a separação do conjunto de 75 isolados em dois grupos de variantes. A identidade nucleotídica par a par entre isolados de grupos distintos variou entre 75 e 85%. Pelos testes de seleção, existe evidência significativa de que vária populações virais estão sobre processo de seleção não neutra. O acúmulo viral não teve diferença significativa entre plantas transgênicas e convencionais. A quantificação também não revelou diferenças em níveis virais em plantas transgênicas originadas de retrocruzamentos com a cultivar Pérola em comparação aos níveis naquelas retrocruzadas com a cultivar BRS Pontal. Os resultados desse trabalho reforçam resultados anteriores de que dois grupos de estirpes de CPMMV estão distribuídos pelas regiões produtoras brasileiras, provavelmente pela presença em plantas daninhas (onde a variabilidade desse vírus nunca foi analisada) e em hospedeiros cultivados como o próprio feijoeiro. Também comprova a alta variabilidade desse vírus de RNA, principalmente nas novas cultivares de feijoeiro resistente ao mosaico dourado por transgenia. É provável que a presença de BGMV nas cultivares convencionais e consequentemente a infecção mista dos dois vírus tenha algum efeito sobre os valores de variabilidade apresentados nesse estudo. Os mecanismos moleculares dessa interação, porém, não são conhecidos. Os resultados apresentados e o fato de que hospedeiros não cultivados estão distribuídos por grandes áreas de produção e que estes podem atuar como reservatório viral, além da grande distribuição da mosca branca pelo Brasil, fazem com que novos trabalhos com esse patógeno sejam de extrema importância.The common bean crop in Brazil, besides its economic importance, represents a major source of what is daily consumed by Brazilian population in terms of proteins and carbohydrates, contributing to food security. Cultivars with a transgenic resistance event to Bean golden mosaic virus (begomovirus), a virus that causes one of the most important diseases of common bean, were developed after many years of research. The release of these cultivars immune to BGMV is undergoing difficulties because of the re-emergence of Cowpea mild mottle virus (carlavirus) in common bean, which has raised some concerns for the researchers and the growers. Although works to access the damage potential into different genotypes of these resistant isolines and to investigate the virus distribution are being reported, no study is found evaluating CPMMV molecular characteristics and diversity in transgenic as well as conventional common bean cultivars in Brazil. In fact, there are very few studies of this kind globally. The objective of this work was to evaluate the variability on CPMMV populations from each of the fifteen common bean cultivars, ten transgenic and resistant to BGMV, and five conventional cultivars, from a field experiment with natural CPMMV transmission by whitefly. CPMMV was also quantified on the three plant replicates of each genotype. Five CPMMV isolates were completely sequenced on all fifteen plants with different genotypes, providing 75 full virus genomes after assembly of PCR sequence blocks. Differences in variability were found between those groups of isolates from transgenic plants to those from conventional ones. With the π, S, K, and Θ-W descriptors, we detected a considerable higher CPMMV variability within transgenic plants in comparison to the virus variability within conventional cultivars in most of the cases. This was the case for all analyzed ORF’s. The ORF’s 2, 3 and 4 were the ones with the highest variability in the genome; at ORF’s 2, 5, and 6, the differences in variability mentioned above are most discernible. Recombination events between isolates happening at the ORF 1 region were detected, as well as at ORF 2 and at ORF 6. Mostly of these were between isolates from transgenic plants. The phylogenetic analysis with ORF 1 sequences of all seventy-five isolates reveals the formation of groups based on host genotypes, and that these groups are most likely grouping near a cluster of isolates from a similar host plant genotype. These could be the result of the direct and specific interactions needed between the viral replicase and the plant. The results of phylogenetic analysis and sequence comparisons with the 3’ region of the viral genome (ORF 2-6), divided the 75 isolates of this study into two groups of CPMMV variants. The pairwise nucleotide differences between isolates from distinct groups ranged from 75 to 85%. The selection tests at some ORF’s give significant evidence that some populations are evolving under a non- random process. The viral accumulation on conventional cultivars did not differ statistically to the accumulation at transgenic plants. In addition, there is no evidence of differences between CPMMV levels at transgenic cultivars that have Pérola as the reccurent parent to those that have the BRS Pontal. The results from this work corroborate with previous studies that indicate the existence of two CPMMV strains naturally distributed in Brazilian production areas. It also confirms the expected high variability potential of this RNA virus; the high variability registered on the newly developed BGMV-resistant transgenic common bean cultivars is also troublesome. The presence of BGMV in mixed infections with CPMMV at conventional cultivars is probably influencing the results of CPMMV variability, but the molecular properties of this interaction is still unknown. These results, in addition to the fact that non-cultivated host plants are distributed along major production areas and may act as viral reservoirs and the known widespread of whiteflies in growing regions of Brazil, make further studies with this pathogen of fundamental importance.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic