Evaluation of the expression of NTPDases 1 and 2 by different evolutionary forms of Leishmania Infantum Chagasi and production of polyclonal antiserum against rLicNTPDase2

Leishmaniose é o nome dado as enfermidades causadas por protozoários do gênero Leishmania que são capazes de gerar diversos quadros de doenças em seres humanos, dependendo da espécie envolvida na infecção podem ocorrer desde lesões cutâneas localizadas a lesões disseminadas e infecção visceral. No Brasil a leishmaniose visceral (LV) é causada principalmente por Leishmania infantum chagasi (syn Leishmania infantum). A LV tem os cães e o homem como principais espécies afetadas, é uma doença endêmica ocorrendo principalmente em regiões rurais, mas que vem apresentando tendência a urbanização. Segundo o ministério da saúde entre 1990 e 2016 foram relatados mais de 75000 casos desta doença no Brasil. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDase são enzimas capazes de hidrolisar nucleotideos di e/ou trifostato e atuam em diversos processos relacionados a infeciosidade deste parasito, além de terem potencial para uso em diagnóstico de LV em cães. Duas isoformas são conhecidas em L. infantum chagasi, uma maior denominada LicNTPDase1 (~70kDa) e uma menor denominada LicNTPDase2 (~40kDa). Até o momento somente as NTPDases recombinates de L. infantum chagasi foram estudadas. Nosso objetivo foi estudar as enzimas nativas do parasito. Nesse trabalho foram realizadas diferentes abordagens: tentativas de purificar ambas enzimas nativas de promastigotas, avaliação da expressão do mRNA relativos às enzimas em diferentes fases evolutivas do parasito, clonagem e expressão solúvel da região que codifica para o ectodomínio da LicNTPDase2. Constatamos a secreção de uma NTPDase com aproximadamente 70 kDa por formas promastigotas. Análises por RT-qPCR mostraram que a LicNTPDase1 é mais expressa em promastigota de fase logarítmica de crescimento e em condições acidófilas, enquanto a LicNTPDase2 possui maior expressão em amastigota que é uma das formas infecciosas do parasito. Estes dados podem reforçar a participação destas enzimas no desenvolvimento e infecciosidade do parasito. Foi possível expressar a LicNTPDase2 em sua forma solúvel, o que nos ajudará em futuros estudos estruturais, enzimáticos e na produção de anticorpos estruturais contra esta proteína.Leishmaniasis is the name given to diseases caused by protozoans of the genus Leishmania that are capable of generating several disease states in humans, depending on the Leishmania species involved in the infection, can occur from localized skin lesions to disseminated lesions and visceral infection. In Brazil the visceral leishmaniasis (VL) is caused by the species Leishmania infantum chagasi and its transmission occurs by the bite of females of the insect Lutzomya longipalpis. VL has dogs and man as main species affected, is an endemic disease occurring mainly in rural regions, but that has been showing a strong tendency to urbanization. According to the Health Ministry between 1990 and 201, more than 75,000 cases of this disease have been reported in Brazil. The Ecto-nucleotidases from the E-NTPDase family are enzymes capable of hydrolyzing di- and / or triphosphate nucleotides and act in several processes related to the infectivity of this parasite, besides being potential for use in the diagnosis of VL in dogs. Two isoforms of these enzymes are known in L. infantum chagasi, LicNTPDase1 (~70kDa) and LicNTPDase2 (~ 40kDa). Until now only the recombinants NTPDases of L. infantum chagasi were studied. Thus, our aim was to work with the native enzymes of the parasite. In this work, different approaches were carried out: attempts to purify both native promastigote enzymes, evaluation of the mRNA expression related to the enzymes in different evolutionary stages of the parasite, cloning and soluble expression of the region encoding the ectodomain of LicNTPDase2. Futhermore, we observed the secretion of an NTPDase with approximately 70kDa by promastigote forms. Analyzes by RT-qPCR showed that the LicNTPDase1 is more expressed in log-phase growth promastigotes and in acidophilic conditions, while the LicNTPDase2 has greater expression in amastigote that is one of the infectious forms of the parasite. These datacan reinforce the participation of these enzymes in parasite development and infectivity. Moreover, it was possible to express the LicNTPDase2 in its soluble form, which will help us in future structural, enzymatic studies and in the production of structural antibodies against this protein.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio