Host cell ura3 for production of recombinant proteins in Kluyveromyces lactis

Foi isolado um mutante auxotrófico para uracila de Kluyveromyces lactis com potencial para ser hospedeiro em sistemas de expressão heteróloga de proteínas recombinantes. Uma população selvagem de K. lactis foi irradiada com luz ultravioleta e selecionada na presença de ácido 5 fluoro orótico (5FOA). Dez colônias auxotróficas para uracila e resistentes a 5FOA foram selecionadas. Todas cresceram em meio utilizando lactose como única fonte de carbono e exibiram atividade de β galactosidase normal em relação à célula selvagem. Os mutantes apresentaram velocidades específicas de crescimento inferiores a da célula selvagem em soro de queijo ultrafiltrado (SUF), o que indicou ser o soro de queijo um meio limitante em uracila, afetando o crescimento dos mutantes. O mutante M7 foi selecionado por apresentar uma freqüência de reversão baixa (1,7 x 10 -10 ). A complementação da auxotrofia na linhagem M7 mediante transformação com o plasmídeo PTG802 contendo o gene URA3 de S. cerevisiae foi analisada. Melhor eficiência de transformação de K. lactis foi obtida com o método de choque térmico com acetato de lítio, polietilenoglicol e DNA carreador fita simples. Um transformante mostrou viiiintegração do plasmídeo em um fragmento de 6,0 Kb. A velocidade de crescimento da célula mutante (0,04 h -1 ) em SUF foi inferior a da célula selvagem (0,26 h -1 ). Estes resultados sugerem que o SUF é limitante em uracila. Conseqüentemente a transformação dos mutantes, com o gene URA3, fisiologicamente causou aumento na velocidade especifica de crescimento (0,22-0,25h -1 ) quando cultivadas em SUF, atingindo os níveis da célula selvagem e evidenciando a complementação da auxotrofia.A Kluyveromyces lactis uracil auxotrophic mutant was isolated with potential as host for heterologous recombinant protein expression systems. A wild-type K. lactis population was irradiated with ultraviolet light and mutants selected in the presence of 5-fluoroorotic acid (5FOA). Ten uracil auxotrophic colonies resistant to 5FOA were selected. All grew in medium with lactose as sole carbon source and exhibited β-galactosidase activity comparable to that of the wild-type cell. The mutants presented specific growth rates lower than the wild-type cell when grown in ultrafiltered cheese whey (SUF), indicating that cheese whey is uracil limited, thereby affecting mutant growth. Mutant M7 was selected since it presented a low reversion frequency (1.7 x 10 -10 ). Auxotrophic complementation of the M7 lineage, through transformation with the PTG802 plasmid containing the URA3 gene from S. cerevisiae was analyzed. Better K. lactis transformation efficiency was obtained with the thermal shock method with lithium acetate, polyethylene glycol and single stranded DNA carrier. One transformed cell presented a 6.0 kb fragment integrated into the plasmid. Transformed cells grown in SUF presented specific growth rates (0,22-0,25 h -1 ) similar to that of the wild-type cell. (0,26 h -1 ) and superior to that of the untransformed mutant cell (0,04 h -1 ). Consistent with this observation, transformation of the mutants with the URA3 gene physiologically causes an increase in specific growth, when grown in SUF, reaching levels of the wild-type cell and exhibiting auxotrophic complementation.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio