Resistance to tospovirus, cloning and molecular characterization of Sw-5 alleles from different Lycopersicon species

O presente trabalho objetivou: 1) avaliar a resistência de acessos de Lycopersicon spp. a tospovírus; 2) estudar a herança da resistência em algumas dessas fontes e 3) clonar e caracterizar molecularmente alelos do loco Sw-5 provenientes de Lycopersicon spp. Plantas de 12 acessos de tomateiro, pertencentes às espécies L. peruvianum, L. chilense e L. hirsutum foram inoculadas com cinco isolados de tospovírus, pertencentes às espécies TSWV, TCSV, CSNV e GRSV. A reação das plantas foi avaliada periodicamente por 30 dias. Ao final desse período, as plantas assintomáticas foram confirmadas como resistentes, mediante DAS-ELISA. A resistência na maioria dos materiais foi de amplo espectro (efetiva contra todos isolados), porém em alguns casos a resistência foi do tipo isolado-es pecífica. Os materiais mais promissores foram os acessos PI 126928, LA 444/1, LA 371 e PI 126944 de L. peruvianum e LA 130 e LA 2753 de L. chilense. Esses materiais constituem fontes de resistência alternativas para o manejo das tospoviroses do tomateiro. O estudo de herança da resistência em L. hirsutum PI 134417 indicou que a resistência nessa fonte é condicionada por dois genes independentes, um dominante e um recessivo. Num teste de alelismo, o gene dominante segregou independentemente do gene Sw-5, indicando que são genes distintos. Em L. peruvianum PI 126928, a resistência segregou como uma característica condicionada por dois ou mais genes dominantes não ligados. Na terceira etapa do trabalho, comparou-se o nível de conservação de alelos do loco Sw-5 em Lycopersicon spp. Os alelos foram obtidos mediante PCR de longo alcance, utilizando-se o sistema ELONGASE TM (Gibco-BRL) para amplificação. Nas reações de amplificação foram utilizadas três combinações de oligonucleotídeos desenhados com base na seqüência do gene Sw-5. Como molde foi utilizado DNA extraído de plantas cuja reação a tospovírus já era conhecida. Foram obtidos 16 alelos do loco Sw-5, provenientes de quatro espécies do gênero Lycopersicon. Após uma pré-caracterização mediante clivagem com enzimas de restrição, 10 clones foram selecionados para seqüenciamento. A análise de seqüência dos alelos revelou identidade de nucleotídeos superior a 91% para a ORF completa. Quando a comparação foi realizada para os diferentes domínios que compõem o gene Sw-5, observou-se que as maiores divergências residem nas extremidades 5’ e 3’ do gene. A comparação entre as proteínas codificadas pelo alelo Sw-5 1 (confere resistência) e seu alelo sw-5 2 (confere suscetibilidade) revelou 53 substituições ao nível de aminoácidos. Destas substituições, 14 são não-sinônimas e se concentram na extremidade amino e nas LRR, indicando o provável envolvimento dessas regiões na especificidade da resistência. A análise funcional dos alelos do loco Sw-5 e a construção de quimeras entre os alelos Sw-5 e sw-5 2 estão em andamento e auxiliarão a estabelecer as bases moleculares da resistência do tomateiro a tospovírus.Lycopersicon peruvianum, L. chilense and L. hirsutum germplasm was inoculated with five isolates from the tospovirus species Tomato spotted wilt virus , Tomato chlorotic spot virus , Chrysanthemum stem necrosis virus, and Groundnut ringspot virus. Several introductions showed resistance to all isolates. However, in some cases, resistance isolate-specific was also observed. PI 126928, LA 444/1, LA 371 and PI 126944 of L. peruvianum and LA 130 and LA 2753 of L. chilense were the most resistant materials. Inheritance studies showed that two independent genes, one dominant and one recessive, control the PI 134417 resistance. Allelism tests revealed that this dominant gene is not an allele of the Sw-5 locus. The resistance derived from PI 126928 segregated as a trait controlled by two or more non-linked dominant genes. Sixteen alleles of the Sw-5 locus were PCR-amplified from four Lycopersicon species, cloned and sequenced. The alleles possess more than 91% of identity at nucleotide level; the largest divergence was observed in the 5 ́and 3 ́ extremities. Sequence comparisons between the resistance allele Sw-5 1 and the susceptible allele Sw-5 2, revealed 53 amino acid substitutions; fourteen substitutions are non-synonymous and located at the amino and carboxi terminus of the protein. The functional analysis of the other alleles and the construction of chimeras between Sw-5 1 and Sw-5 2 will allow to identify the protein region involved in the resistance specificity.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio