Molecular characterization and identification of Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20

A estirpe probiótica Lactobacillus UFV H2b20, previamente classificada como Lactobacillus acidophilus por suas características de fermentação de açúcares, apresentou-se mais semelhante à espécie Lactobacillus delbrueckii, quanto à seqüência de rDNA 16S, o que levou ao questionamento acerca da identidade da linhagem. Para o esclarecimento da real classificação da linhagem, o método de hibridização DNA-DNA foi empregado. A linhagem apresentou 75,2% e 77,4% de reassociação com L. delbrueckii subsp. lactis (ATCC 12315) e L. delbrueckii subsp. delbrueckii (ATCC 9649), respectivamente. Dado que a homologia de 70% ou mais, por esse método, tem sido usada como padrão para agrupamento de bactérias em uma mesma espécie, sugere-se, aqui, que Lactobacillus UFV H2b20 seja, daqui para frente, denominado L. delbrueckii UFV H2b20. Identificada a linhagem, outro objetivo do trabalho era desenvolver um protocolo para detecção in situ de L. delbrueckii. Uma sonda de 26 nucleotídeos (SA) foi construída e testada com outras espécies de Lactobacillus relacionadas geneticamente entre si. Estes estudos demonstraram que a seqüência de assinatura (SA) estava presente em L. delbrueckii UFV H2b20, L. delbrueckii UFV H2b21, L. delbrueckii subsp. delbrueckii e L. delbrueckii subsp. lactis, o que indica ser ela eficaz para ser usada como sonda para rRNA 16S espécie-específica pelo método de FISH. A hipótese de existência de polimorfismos, levantada em trabalhos prévios no rDNA 16S da linhagem, foi confirmada após as análises dos segmentos de DNA clonados e selecionados do banco genômico construído para a linhagem L. delbrueckii UFV H2b20. As seqüências analisadas demonstraram, também, presença de segmentos correspondentes a quatro genes codificadores de rRNA 16S distintos, e seis segmentos distintos para uma mesma região de rRNA 23S, indicando seis operons putativos. Há evidência de, pelo menos, um operon putativo completo seguido de região codificadora de seis tRNAs. Não se detectou região espaçadora longa entre rDNA 16 e 23S.Lactobacillus UFV H2b20, a probiotic strain, previously identified as Lactobacillus acidophilus due to its sugar fermentation pattern, was found to be more closely related to Lactobacillus delbrueckii regarding its 16S rDNA sequence. It was demonstrated by DNA-DNA hybridization that this strain presented 75.2% and 77.4% of reassociation with L. delbrueckii subsp. lactis ATCC 12315 and L. delbrueckii subsp. delbrueckii ATCC 9649, respectively. These results place Lactobacillus UFV H2b20 within the L. delbrueckii species, for 70% reassociation as measured by the method used has been a standard to cluster bacteria within the same species. A protocol for in situ detection of L. delbrueckii was developed by means of Fluorescent in situ Hybridization, FISH. A probe consisting of 26 nucleotides labeled with rhodamine was designed based on the signature sequence within the rDNA, and was tested against genetically related Lactobacillus species. A species- specific method was obtained capable of discriminating L. delbrueckii strains from other Lactobacillus species. Previous studies raised the hypothesis of polymorphism among the copies of 16S rDNA in L. delbrueckii UFV H2b20. This was confirmed by sequence analysis of rDNA from a gene library of this strain cloned in phage lambda and subcloned in pBluescript. Sequence analyses of cloned fragments demonstrated the presence of at least four distinct genes encoding 16S rRNAs. Distinct fragments containing 23S rRNA related genes indicated six putative rrn operons. One complete putative rrn operon displays a region encoding 6 different tRNAs. Long spacer regions between 16S and 23S rDNA were not detected.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerai