Antimicrobial evaluation of eugenol nanocarrier in bacterial isolates of bovine mastitis

A mastite bovina ocasiona a inflamação da glândula mamária, podendo ser contagiosa ou ambiental. Antimicrobianos não convencionais, como o eugenol, pode ser uma alternativa para o controle desta enfermidade. Porém a elevada hidrofobicidade e volatilização do eugenol, dificultam sua utilização em sistemas aquosos. Visando minimizar estes aspectos negativos, foram obtidos nanocarreadores à base de Albumina Sérica Bovina (BSA) veiculando eugenol (E) em diferentes pH (3,5, 5,0 e 7,0) e avaliado sua ação antimicrobiana pela Concentração Mínima Inibitória (CMI), Concentração Mínima Bactericida (CMB), teste de difusão em ágar; viabilidade celular por citometria de fluxo (CMF), Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e teste de imersão para remoção de células aderidas em cupons. A caracterização físico-química dos nanocarreadores foi realizada por tamanho, potencial zeta, estabilidade cinética e docking molecular. As amostras BSA-E apresentaram pela técnica de microdiluição, CMB iguais paraS. aureus e E. coli: de 0,27 μL· mL^-1 para BSA-E em pH 3,5 e 0,55 μL· mL^-1 em pH 5,0 e 7,0. Em contrapartida, as amostras com eugenol livre (E) apresentaram CMB com concentrações mais elevadas: 1,10 μL· mL^-1 em pH 3,5 e 2,20 μL· mL^-1 em pH 5,0 e 7,0. A partir da análise por CMF, foi verificado que as amostras com BSA-E independentemente do pH e da estrutura da parede celular, foram capazes de inativar mais de 99% das células de isolados bacterianos em menor tempo de imersão (5 min). Estes dados corroboram com as análises de MEV, que demostraram acentuada modificação na estrutura da membrana celular após imersão com BSA-E por 30 min. A partir do teste de imersão por 30 min, de cupons de aço inoxidável e borracha utilizada em teteiras de ordenhadeiras mecânicas com células aderidas de E. coli e S. aureus, foi possível verificar que somente as formulações BSA-E, independentemente do pH, atenderam às recomendações da Organização Mundial de Saúde (OMS) de até 50 UFC·cm^-2 de mesófilos aeróbios, para a superfície de aço-inoxidável, embora constatado, uma redução de 99,99% de células aderidas na superfície da borracha. As amostras BSA e BSA-E, em pH 3,5, apresentaram diâmetro hidrodinâmico de 10,66 ± 0,13 nm e 11, 03 ± 0,015 nm, respectivamente, superior ao pH 5,0 (7,39 ± 0,18 nm e 7,95 ± 0,014 nm) e pH 7,0 (8,12 ± 0,29 nm e 8,17 ± 0,13 nm). Em pH 3,5 o potencial zeta para BSA e BSA-E foram respectivamente de + 8,8 ± 0,14 mV e + 8,91 ± 0,15 mV. Para o pH 5,0 e 7,0 foram de -3,95 ± 0,09 mV e - 4,12 ± 0,12 Mv e -12,57 ± 0,18 mV e -12,39 ± 0,13 mV, para BSA e BSA-E, respectivamente. Os valores de diâmetro hidrodinâmico, potencial zeta e pH, mantiveram-se estáveis durante 15 dias. A técnica por docking molecular, foi capaz de predizer que a ligação eugenol com a BSA foi termodinamicamente favorável, e que eugenol está localizado no interior de um bolsão formado pela interação entre os três domínios (I, II e III) da BSA, sendo este bolsão composto principalmente de aminoácidos hidrofóbicos e básicos, que favoreceram a interação do ligante com a proteína. Neste contexto o eugenol nanocarreado por BSA demonstra ser uma alternativa viável para o controle e ou prevenção da mastite bovina ocasionada por E. coli e ou S. aureus.Bovine mastitis causes inflammation of the mammary gland, and may be contagious or environmental. Unconventional antimicrobial agents, such as eugenol, may be an alternative for the control of this disease. However, the high hydrophobicity and volatilization of eugenol make it difficult to use in aqueous systems. In order to minimize these negative aspects, Bovine Sodium Albumin (BSA) nanocarriers were obtained by carrying eugenol (E) at different pH (3.5, 5.0 and 7.0) and evaluated its antimicrobial action by the Minimal Inhibitory Concentration), Minimum Bactericidal Concentration (CMB), agar diffusion test; Cell viability by flow cytometry (CMF), Scanning Electron Microscopy (SEM) and immersion test to remove adhered cells in coupons. The physico-chemical characterization of the nanocarreadores was performed by size, zeta potential, kinetic stability and molecular docking. The BSA-E samples showed the same microbial dilution for S. aureus and E. coli: 0.27 μL · mL^-1 for BSA-E at pH 3.5 and 0.55 μL · mL^-1 PH 5.0 and 7.0. In contrast, formulations with free eugenol (E) showed higher concentrations of CMB: 1.10 μL · mL ^-1 at pH 3.5 and 2.20 μL · mL^-1 at pH 5.0 and 7.0. From the CMF analysis, it was verified that BSA-E samples, regardless of pH and cell wall structure, were able to inactivate more than 99% of the cells of bacterial isolates in a shorter immersion time (5 min). The results corroborate the SEM analyzes, which demonstrated a marked change in the cell membrane structure after immersion with BSA-E for 30 min. From the 30 min immersion test of stainless steel coupons and rubber used in mechanical milking teats with adhered E. coli and S. aureus cells, it was possible to verify that only the BSA-E formulations, regardless of pH, Met the recommendations of the World Health Organization (WHO) of up to 50 CFU · cm -2 of aerobic mesophiles, for the stainless-steel surface, although found, a 99.99% reduction of adhered cells on the rubber surface. The BSA and BSA-E samples, at pH 3.5, had a hydrodynamic diameter of 10.66 ± 0.13 nm and 11.03 ± 0.015 nm, respectively, higher than pH 5.0 (7.39 ± 0.18 Nm and 7.95 ± 0.014 nm) and pH 7.0 (8.12 ± 0.29 nm and 8.17 ± 0.13 nm). At pH 3.5 the zeta potential for BSA and BSA-E were respectively 8.8 ± 0.14 Mv and + 8.91 ± 0.15 Mv respectively. For pH 5.0 and 7.0 were -3.95 ± 0.09 Mv and - 4.12 ± 0.12 Mv and -12.57 ± 0.18 Mv and -12.39 ± 0.13 Mv, for BSA and BSA- E, respectively. The values of hydrodynamic diameter, zeta potential and pH remained stable for 15 days. The molecular docking technique was able to predict that the eugenol binding with BSA was thermodynamically favorable, and that eugenol is located inside a pocket formed by the interaction between the three BSA domains (I, II and III), this being A pocket composed mainly of hydrophobic and basic amino acids that favored the interaction of the ligand with the protein. In this context, BSA nanoparenolated eugenol is a viable alternative for the control and / or prevention of bovine mastitis caused by E. coli and / or S. aureus.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic