Analysis of soybean BiP (binding protein) promoter activity in tobaco transgenic lines

A proteína BiP ("binding protein") de plantas tem sido descrita como um importante mediador de translocação, dobramento e montagem de proteínas recém-sintetizadas no lúmem do retículo endoplasmático, exibindo uma forte indução em resposta a uma variedade de estresses bióticos e abióticos. Apesar de sua relevância funcional, muito pouco se sabe com relação aos mecanismos de regulação da expressão dos genes BiP de plantas e da estrutura de seus promotores. Nesta investigação, dois promotores de BiP de soja, designados gsBiP6 e gsBiP9, bem como diferentes extensões de suas extremidades 5' foram fusionados ao gene repórter beta-glucuronidase (GUS) e introduzidas em Nicotiana tabacum via transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Os promotores de gsBiP6 e gsBiP9 possuem cis-elementos gerais, característicos de promotores de genes de plantas, como as seqüências de transcrição CAAT e TATA, e cis-elementos que respondem a estresses do retículo endoplasmático (ERSE), além de seqüências relacionadas com o G-box. Ensaios de atividade de GUS em discos foliares transformados com os genes quiméricos BiP6-GUS e BiP9-GUS demonstraram que o promotor de gsBiP6 é induzido por uma variedade de estresses, enquanto gsBiP9 é induzido apenas por tunicamicina, um potente ativador da via de resposta a proteínas mal-dobradas (UPR). Além disso, análises histoquímicas de plantas transformadas com as construções -358pbip6-gus (BiP6) e -2200pbip9-gus (BiP9) revelaram que os promotores de BiP produziram um padrão intenso e uniforme de expressão de GUS em folhas, caules, raízes e meristemas apicais. Este padrão de distribuição espacial da atividade de GUS está correlacionado com uma expressão desses genes em tecidos que apresentam alta atividade celular secretória e alta proporção de células em um processo ativo de divisão celular. Análises de deleções do promotor de gsBiP9 em plantas transformadas identificaram dois domínios regulatórios cis-atuantes, denominados CRD-1 (-1090 a -670) e CRD-2 (-670 a +1), que são importantes para regulação espacial dos promotores de BiP em condições normais de desenvolvimento. A região de CRD-1 é caracterizada pela predominância quase absoluta de adenina e timina exibindo uma alta atividade do gene repórter GUS. Este domínio funcional possui uma atividade similar à de “enhancer”, já que é capaz de restaurar altos níveis de expressão quando fusionado diretamente à extremidade 5’ do promotor de BiP9. De fato, a atividade do gene repórter -glucuronidase (GUS) nas plantas contendo esse domínio regulatório cis-atuante foi praticamente idêntica àquela exibida pelo promotor inteiro. Além disso, a análise histoquímica e fluorimétrica de plantas contendo tais seqüências mostraram um aumento significativo na atividade do gene repórter GUS. A região de CDR-2 é caracterizada por conter elementos regulatórios positivos, que coordenam a expressão tecido-específica do promotor de gsBiP9, sendo capaz de restaurar em parte, os níveis de expressão basal do gene repórter GUS, uma vez que se detectou atividade do promotor em raízes e caule, entretanto, os níveis de expressão em folhas, principalmente na região dos feixes vasculares, não foram suficientemente altos e nem tão pouco de forma generalizada como visto nas construções contendo o promotor completo de BiP, sendo necessário seqüências adicionais delimitadas até a posição -1090 para uma alta atividade. Estes resultados sugerem que o controle da expressão dos genes BiP de plantas envolve múltiplos e complexos mecanismos e depende de uma complexa integração de múltiplos cis-elementos regulatórios no promotor.Plant BiP (binding protein) has been described as an important mediator of translocation, folding and assembly of nascent secretory proteins in the endoplasmic reticulum lumen and it responds to a variety of biotic and abiotic stresses. Despite its functional relevance, little is known about the regulation mechanisms of plant BiP gene expression and the structure of their promoters. Here, we have fused two BiP promoters, designated gsBiP6 and gsBiP9, as well as different extensions of their 5'-flanking sequences to beta-glucuronidase (GUS) reporter gene and introduced into Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The gsBiP6 and gsBiP9 promoters possess cis-regulatory elements of most plant promoters, such as CAAT e TATA boxes, in addition to potential regulatory cis-elements, such as endoplasmic reticulum stress elements (ERSE) and G-box-related sequences. GUS activity assays from leaf discs expressing BiP6- GUS e BiP9-GUS demonstrated that gsBiP6 promoter is induced by a variety of stress conditions, whereas the induction of gsBiP9 is restricted to tunicamycin treatment, a potent activator of the unfolded protein response (UPR) pathway. Furthermore, histochemical analysis of transgenic lines harbouring -358pbip6-gus (BiP6) and -2200pbip9-gus (BiP9) revealed that BiP promoters drove an intense and uniform pattern of GUS expression in leaves and stems, with the expression of BiP genes in tissues with high secretory activity and in regions of intense cell division. Promoter deletion analyses allowed to identify two cis-regulatory functional domains, designated CRD-1 (-1090 to -670) and CRD-2 (-670 to +1), that are important for the spatially-regulated activation of BiP expression under normal plant development. CRD-1 corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. CDR-2 is able to maintain a basal expression of the reporter gene in root, stem and leaves and, most likely, it contains all the required elements of a eukaryotic promoter. In spite of that, the gene reporter expression levels driven by CRD-2 domain were not sufficiently high in these organs, and GUS activity were not detected in apical meristems. In fact, the BiP promoter activity in meristematic tissues requires the presence of a second activating domain CRD-1 (-1090 to -670), that corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. These results suggest that the tissue-specific control of BiP gene expression requires a complex integration of multiple cis- acting regulatory elements on the promoter