Characterization and expression of the RNA chaperone Hfq in Actinobacillus pleuropneumoniae, the causative agent of porcine pleuropneumonia

Infecções que acometem o trato respiratório de suínos levam a significativas perdas econômicas na suinocultura mundial. Um dos principais patógenos respiratórios em suínos é a bactéria Actinobacillus pleuropneumoniae, o principal agente causal da pleuropneumonia. Atualmente podem ser encontrados 16 sorotipos de A. pleuropneumoniae com virulência distinta e complexa, sendo os principais fatores de virulência: exotoxinas Apx, lipopolissacarídeo (LPS), cápsula e a capacidade de formação de biofilme. O controle da doença é baseado no uso de antibióticos e cuidados no manejo da granja. A profilaxia pela imunização passiva ainda é ineficiente devido à dificuldade na obtenção de uma vacina contra todos os sorotipos encontrados. Assim, novas abordagens experimentais na elaboração de uma vacina eficiente associada a uma resposta imune protetora são essenciais porque podem representar novas alternativas na estratégia de controle da doença. A proteína Hfq é um componente central de regulação global pós-transcricional e participa diretamente na regulação da expressão de genes por facilitar a interação de RNAs pequenos com mRNAs alvos, sendo esta uma abordagem atual e relacionada ao controle da virulência em diversas bactérias patogênicas. Neste sentido, o estudo da chaperona de RNA Hfq é de extrema importância, uma vez que já foi demonstrado seu efeito pleiotrópico e impacto na virulência, na resposta a diferentes tipos de estresse e no crescimento celular de vários patógenos, incluindo A. pleuropneumoniae. Portanto, esse trabalho teve como objetivos: caracterizar in silico a proteína Hfq em A. pleuropneumoniae e analisar a expressão e a fase de maior abundância desta proteína ao longo do crescimento de A. pleuropneumoniae. As análises filogenéticas realizadas foram baseadas em análises de comparação de sequências de aminoácidos da proteína Hfq de diferentes membros da classe Gammaproteobacteria, na qual A. pleuropneumoniae está inserida. As demais análises foram conduzidas utilizando os sorotipos 1, 8 e 15 de A. pleuropneumoniae, sendo utilizadas as linhagens do tipo selvagem (WT) e hfq::3XFLAG. O alinhamento de sequências da proteína Hfq revelou uma identidade de 98% entre as proteínas Hfq de A. pleuropneumoniae de diferentes sorotipos, além de demonstar que Hfq de espécies de uma mesma família possuem maior relação filogenética. A análise da estrutura tridimensional da proteína em A. pleuropneumoniae demonstrou a presença de estruturas características da proteína presente em outos patógenos Gram-negativos, como uma α-hélice e folhas β. A análise da velocidade específica de crescimento por ANOVA entre as linhagens WT e hfq::3XFLAG do mesmo sorotipo revelou que não há diferença de crescimento entre essas linhagens do mesmo sorotipo. Quanto à expressão de Hfq, foi detectado um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, no período de 6-8 horas, dependendo do sorotipo investigado, e que a expressão de Hfq foi diferencial entre os sorotipos analisados. Esses resultados revelaram que a proteína Hfq é conservada entre os sorotipos de A. pleuropneumoniae e possui estrutura tridimensional característica. Além disso, a inserção da etiqueta FLAG em Hfq não alterou o perfil de crescimento celular e hà um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, sendo que os sorotipos apresentaram distribuição das formas diferencial entre os sorotipos e dinâmica de acordo com a fase de crescimento. Essa diferença pode estar relacionada aos diferentes perfis de virulência e de resposta a diferentes condições investigadas previamente, uma vez que a abundância nestes sorotipos apresentou distribuição temporal distinta.Infections that affect the respiratory tract of pigs lead to significant economic losses in the swine industry worldwide. One of the major respiratory pathogen in pigs is the bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae, the main causal agent of the pleuropneumonia. Currently, 16 serotypes can be found of A. pleuropneumoniae with distinct and complex virulence, with the main factors of virulence: exotoxin Apx, lipopolysaccharide (LPS), capsule and the biofilm formation capacity. Control of the disease is based on the use of antibiotics and care in the management of the farm. Prophylaxis by passive immunization is still inefficient because of the difficulty in getting a vaccine against all serotypes found. Thus, new experimental approaches in the development of an effective vaccine associated with a protective immune response are essential because they can represent new alternatives in the disease control strategy. The Hfq protein is a key component of the global post-transcriptional regulation and directly participates in the regulation of gene expression to facilitate the interaction of small RNAs with target mRNAs, which is a current approach and it relates to the control of virulence in many pathogenic bacteria. In this sense, the study of Hfq RNA chaperone is of extreme importance, since it has already demonstrated its pleiotropic effect and impact on virulence in response to different types of stress and cellular growth of various pathogens, including A. pleuropneumoniae. Therefore, this study aimed: to characterize in silico the Hfq protein in A. pleuropneumoniae and to analyze the expression and phase greater abundance of this protein throughout the growth of A. pleuropneumoniae. The phylogenetic analyzes were based on comparative analysis of amino acid sequences of protein Hfq of different members of the class Gammaproteobacteria, which A. pleuropneumoniae is inserted. The other analyzes were conducted using the serotypes 1, 8 and 15 of A. pleuropneumoniae, being used strains of wild-type (WT) and hfq::3XFLAG. The sequence alignment of Hfq protein sequences showed an identity of 98% between Hfq proteins of A. pleuropneumoniae of different serotypes, also demonstrating that Hfq species of the same family have a greater phylogenetic relationship. The analysis of the three-dimensional structure of the protein in A. pleuropneumoniae demonstrated the presence of specific structures of protein present in other Gram-negative pathogens, how one α-helix and β-strands. The analysis of the specific growth rate by ANOVA between strains WT and hfq::3XFLAG of the same serotype showed that there is no difference in growth between the strains. As the expression of Hfq, a greater accumulation of protein in the stationary growth phase was detected in the period of 6-8 hours, depending on the serotype investigated, and the expression of Hfq was differential between serotypes analyzed. These results demonstrate that Hfq is conserved among serotypes of A. pleuropneumoniae and has a three-dimensional structure conserved. Moreover, the insertion of the FLAG tag on Hfq did not affect the cell growth profile and there is a greater accumulation of the protein in the stationary phase of growth, whereas serotypes showed the distribution of forms differential between serotypes and dynamically according to the growth stage. This difference may be related to different profiles of virulence and response to different conditions previously investigated, since these abundant serotypes showed distinct temporal distribution.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic