Genomic analysis and determination of reference proteome of clinic isolates of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 8

Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, uma doença respiratória severa que resulta em significantes perdas econômicas no setor da suinocultura. Atualmente, A. pleuropneumoniae é classificado em 16 sorotipos diferentes que podem causar a doença com virulência distinta entre eles. Em Minas Gerais, Brasil, A. pleuropneumoniae é encontrado nas granjas e a maior distribuição é do sorotipo 8, sendo este até pouco tempo negligenciado em estudos de epidemiologia devido a problemas de identificação. Da mesma forma, atualmente é aceito que este sorotipo é também o de maior distribuição nos Estados Unidos, Canadá, Reino Unido além do Brasil. Até recentemente, não havia disponibilidade de genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 em banco de dados, por isso não existem informações genômicas específicas para este sorotipo, especialmente provenientes de isolados clínicos recentemente circulantes nas granjas. Neste contexto, somente a partir de 2015 os primeiros genomas foram disponibilizados para serem analisados, sendo assim sete genomas de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 estão hoje disponíveis e estes foram analisados neste estudo. A partir das sequências genômicas dos isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 foi proposto um modelo de proteoma referência desse sorotipo com um total de 2.396 proteínas categorizadas nas diferentes classes de grupos de ortólogos. Na análise comparativa realizada entre genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 e demais sorotipos foi observado um padrão de conservação na organização do genoma entre esses. No entanto, foram identificadas algumas diferenças pontuais e dois segmentos genômicos diferenciais entre os genomas analisados com rearranjos e /ou inversões de 42,2 Kb e 59,6 Kb. O primeiro segmento foi encontrado nos genomas dos sorotipos 5 (L20), 7 (AP76) e em quatro dos isolados clínicos do sorotipo 8 investigados, sendo eles MV518, MV780, MV1022 e MV5651 contendo sequências de profago. O segundo segmento diferencial foi identificado apenas no genoma de A. pleuropneumoniae sorotipo 7 (AP76) e contém sequências como transposases caracterizando a presença de uma sequência de inserção no segmento. De acordo com a análise dos códons preferenciais de todos os sorotipos investigados, não foram observadas diferenças marcantes entre eles. Na análise comparativa dos proteomas, a maioria das sequências do proteoma referência de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 que apresentaram baixa similaridade com os demais sorotipos foram caracterizadas como hipotéticas, não tendo sua função conhecida. Nessa porção diferencial específica foram relatadas sequências codificadoras relacionadas à plasmídeos o que caracteriza possíveis eventos de transferência horizontal de genes (THG) ao longo da história evolutiva do genoma e fatores de resistência a antibióticos como cloranfenicol, sulfonamida e tetraciclina. Na análise de similaridade entre os proteomas houve maior similaridade das proteínas do proteoma referência do sorotipo 8 com as proteínas do sorotipo 6, o que pode estar associado à dificuldade em separar esses sorotipos nas técnicas de sorotipagem. Com as análises comparativas e a caracterização das diferenças entre os sorotipos e isolados será possível compreender os mecanismos de virulência dos isolados de A. pleuropneumoniae e identificar potenciais candidatos vacinais mais eficientes.Actinobacillus pleurapneumoniae is the causative agent of porcine pleuropneumonia, a severe respiratory illness that it results in significant economic losses in the swine industry. Currently, A. pleuropneumoniae is classified into 16 different serotypes that it can cause disease with distinct virulence between them. In Minas Gerais, Brazil, A. pleuropneumoniae is found on the farms and the largest distribution is of serotype 8, which, until shortly time, it was neglected in epidemiological studies because of the identification problems. Similarly, it is currently accepted that this serotype is also the most widely distributed in the United States of America, Canada, the United Kingdom as well as Brazil. Until recently, there was no availability of genomes of A. pleuropneumoniae serotype 8 in the database, because of this, there are no specific genomic information for this serotype, especially from of the clinical isolates that, recently, it are circulating on the farms. In this context, only from 2015, the first genomes were available to be analysed, so, today there are seven genomes of clinical isolates of A. pleuropneumoniae serotype 8 available and these were analyzed in this study. From the genomic sequences of clinical isolates of A. pleuropneumoniae serotype 8 was proposed a model of proteome which it is reference for this serotype with a total of 2.396 proteins categorized into different classes of orthologous groups. In a comparative analysis of genomes of A. pleuropneumoniae serotype 8 and other serotypes, it was observed a pattern of conservation in the organization of the genome between these. However, it were identified some specific differences and two genomic segments differentials between the genomes analyzed with rearrangements and/or reversals of 42.2 Kb and 59.6 Kb. The first segment was found in the genome of the serotype 5 (L20), 7 (AP76) and in four of the clinical isolates of serotype 8 that it were investigated: MV518, MV780, MV1022 and MV5651, which it containing prophage sequences. The second differential segment was identified only in the genome of A. pleuropneumoniae serotype 7 (AP76) and it contains sequences as transposases that it characterizes the presence of an insertion sequence in the segment. Regarding the use and the preference of codons between the serotypes investigated, there were no significant differences among them. In the comparative analysis of proteomes, the sequences of the reference proteome of A. pleuropneumoniae serotype 8, which it showed low similarity with the remaining serotypes, it were identified as hypothetical, it does not having its known function. In this specific differential portion, coding sequences associated to plasmids were described, that it characterize possible events by horizontal transfers of genes (HTG) throughout the evolutionary history of the genome and antibiotic resistance factors, such as chloramphenicol, tetracycline and sulfonamide. In the similarity analysis between the proteomes, there was greater similarity of the proteome reference of serotype 8 with the proteins of the serotype 6, which it may be associated on difficulty to separate these serotypes in the serotyping techniques. With the comparative analysis and the characterization of the differences between the serotypes and the isolates, it will be possible to understand the virulence mechanisms of the isolates of A. pleuropneumoniae and to identify vaccine candidate potential more effective.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic