Detection and molecular and biological characterization of virus associated to phytopathogenic fungi

Os fungos fitopatogênicos são um grupo importante de microrganismos responsáveis por perdas significativas na agricultura em todo o mundo. A capacidade que alguns apresentam de infectar todas as partes da planta, bem como a capacidade de sobrevivência no solo os torna um importante grupo de fitopatógenos. O controle de doenças causadas por fungos geralmente requer medidas que utilizam tratamentos químicos, o que gera um impacto ambiental e à saúde humana. Micovírus são vírus que infectam fungos. Alguns micovírus apresentam capacidade de tornar seus hospedeiros hipovirulentos e ainda são capazes de transferir essa propriedade a outros isolados compatíveis. O controle de fungos fitopatogênicos com micovírus constitui uma alternativa que pode reduzir o uso do controle químico. Além disso, pode ser eficaz contra doenças para as quais não há controle químico nem plantas resistentes disponíveis. Assim o objetivo desse trabalho foi acessar a diversidade de micovírus associada a fungos fitopatogênicos e estudar o impacto desses vírus sobre a fisiologia dos hospedeiros. Foi investigada a presença de micovírus em isolados fúngicos obtidos em coleções de culturas, feira livre e também do campo em plantas sintomáticas. Dos 42 isolados fúngicos analisados, 11 (26%) continham dsRNA. Todos com distintos padrões de dsRNA, observados por eletroforese em gel de agarose. Em um isolado de Chalara elegans, agente causal da podridão negra em raiz, foi detectado presença de partículas icosaédricas com 33 nanômetros de diâmetro. SDS-PAGE a partir do purificado viral revelou a presença de três proteínas estruturais com massa molecular estimada em 38, 40 e 45 kDa. Também foi realizada a caracterização molecular e biológica de um micovírus obtido a partir do fungo Sclerotinia sclerotiorum isolado Ss24, agente causal do mofo branco, doença presente em diversas espécies de plantas. O genoma possui 2.700 nucleotídeos e apresenta uma única sequência aberta de leitura (ORF) que codifica uma RNA polimerase dependente de RNA, com domínios conservados na superfamília de RdRps de mitovirus, um grupo de vírus que replica em mitocôndrias das células hospedeiras. Análises filogenéticas indicam que o vírus detectado é um novo membro do gênero Mitovirus. Análise do perfil de bandas de dsRNA obtido a partir do isolado Ss24 sugere que há uma co-infecção por mais de um micovirus. Uma linhagem isogênica obtida por reprodução sexuada do isolado Ss24 revelou um padrão diferente do seu parental. Ambos, parental (Ss24) e isolado isogênico (Ss24MVF) foram comparados quanto produção de escleródios, ácidos totais, ácido oxálico, taxa de crescimento, morfologia e pigmentação das colônias e patogenicidade em plantas de Phaseolus vulgaris, Capsicum annuum e Nicotiana benthamiana. Os resultados revelaram que o isolado Ss24 foi severamente debilitado em todas as características fisiológicas analisadas quando comparado com o isolado Ss24MVF. Maior concentração de mitocôndrias nas hifas também foi observado no isolado Ss24. Em conjunto estes resultados confirmam que os vírus que infectam fungos estão distribuídos nas diferentes espécies de fungos. A presença de determinados segmentos de dsRNA pode conduzir o fenótipo da hipovirulência em fungos. Uma análise mais aprofundada sobre as características destes micovírus podem levar ao desenvolvimento de ferramentas para estudos sobre os mecanismos de patogenicidade dos fungos, bem como a utilização desses vírus como agentes de controle biológico.The phytopathogenic fungi are an important group of microorganisms responsible for significant losses in agriculture throughout the world. The ability that some have to infect all parts of the plant, as well as the ability to survive in the soil becomes an important phytopathogens group. The control of disease caused by fungi usually requires measures using chemical treatments leading an environmental impact and to human health. Mycovirus are viruses that infect fungi. Some mycovirus present ability to make their hipovirulentos hosts and are still able to transfer that property to other compatible isolated. The control of pathogenic fungi with mycovirus is an alternative that can reduce the use of chemical control. Furthermore, it may be effective against diseases for which no chemical control or resistant plants available. So the aim of this study was to access the mycovirus diversity associated with pathogenic fungi and to study the impact of these viruses on the physiology of the host. The presence of mycovirus in fungal isolates from culture collections, free fair and also the field in symptomatic plants was investigated. Of the 42 fungal isolates analyzed, 11 (26%) contained dsRNA. All isolates showed patterns different dsRNA observed by agarose gel electrophoresis. A strain Chalara elegans, the causal agent of black rot on root was detected the presence of icosahedral particles 33 nanometers in diameter. SDS-PAGE from purified viral revealed the presence of three structural proteins with molecular weight estimated at 38, 40 and 45 kDa. Was performed the molecular and biological characterization of a mycovirus obtained from the fungus Sclerotinia sclerotiorum strain Ss24, causal agent of white mold, disease present in several plant species. The genome has 2.700 nucleotides and a single open reading frame sequence (ORF) encoding a RNA-dependent RNA polymerase with conserved domains of the superfamily of RdRps mitovirus, a group of viruses that replicate in mitochondria of host cells. Phylogenetic analysis indicate that the virus detected is a new member of the genus Mitovirus. Analysis of the profile segments dsRNA obtained from strain Ss24 suggests that there is coinfection by more than one mycovirus. An isogenic strain obtained by sexual reproduction (Ss24MVF) revealed a different pattern of their parent strain. Both Ss24 and isogenic strains Ss24MVF were compared for sclerotia, total acid, oxalic acid production, growth rate, morphology and pigmentation of colonies and pathogenicity in plants of Phaseolus vulgaris, Capsicum annuum and Nicotiana benthamiana. The results revealed that the strain Ss24 was severely impaired in all analyzed physiological characteristics compared with the single Ss24MVF. Higher concentration of mitochondria in hyphae were observed on strain Ss24. Together, these results confirm that viruses that infect fungi are distributed in different species of fungi. The presence of certain segments of dsRNA can drive the phenotype of hypovirulence fungi. A detailed analysis of the characteristics this is mycovirus can lead to the development of tools for studies on fungi pathogenic mechanisms, and the use of these viruses as biological control agents.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio