In vitro culture of Lippia filifiolia Mart. (Verbenaceae): leaf anatomy, and effect of light irradiances and growth regulators

O gênero Lippia (Verbenaceae) possui importância econômica devido aos diferentes usos do óleo essencial presente em suas espécies, que ocorrem em grande número no Brasil. Lippia filifolia Mart. & Schau. é endêmica da Cadeia do Espinhaço, em Minas Gerais, e está ameaçada de extinção. Plantas estabelecidas in vitro demonstraram que a espécie é sensível à mudanças de ambiente, durante o processo de aclimatação. O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar o cultivo in vitro de L. filifolia, analisando a influência de níveis de irradiância e de meios de cultivo suplementados com diferentes reguladores de crescimento, visando subsidiar a produção de plantas mais tolerantes à aclimatação. Ápices caulinares foram cultivados nos meios MSO, MS + ANA (0,1 mg L -1 ), MS + BAP (0,5 mg L -1 ), MS + ANA (0,1 mg L -1 ) + BAP (0,5 mg L -1 ) e, submetidos aos níveis de irradiância 40, 104 e 172 μmol m -2 s -1 . Interações significativas entre as variáveis níveis de irradiância e meios de cultivo foram obtidas para as características concentração de carotenóides, crescimento em altura, número de brotações e área foliar. As clorofilas a, b e totais foram influenciadas somente pela irradiância, diminuindo a concentração de acordo com o aumento da irradiância. O fator meio de cultivo influenciou o número e o tamanho das raízes, o peso de matéria fresca da parte aérea e a concentração de antocianinas. Não houve interação para as características peso de matéria fresca e seca do sistema radicular e peso de matéria seca da parte aérea, no entanto, os fatores irradiância e meio de cultivo, analisados isoladamente, foram significativos para tais características. Os níveis de irradiância e os meios de cultivos utilizados influenciaram no desenvolvimento da parte aérea, mas, não comprometendo a sobrevida da planta no decorrer do experimento. As variações nos níveis de irradiância não influenciaram a biossíntese de antocianinas, demonstrando que as condições a que L. filifolia foi submetida, não induziram elevados níveis de estresse para as plantas. O segundo objetivo deste trabalho foi caracterizar anatomicamente, mediante microscopia de luz e eletrônica de varredura, a folha de L. filifolia cultivada in vitro, e identificar por técnicas histoquímicas, as principais substâncias presentes no órgão. As avaliações histoquímicas foram conduzidas em material fresco e em amostras incluídas em resina sintética. A estrutura foliar segue o padrão descrito para outras espécies do gênero, todavia, apresentando características anatômicas, geralmente, relacionadas às plantas cultivadas in vitro, como cutícula delgada, grandes espaços intercelulares, ausência de tecidos de sustentação e folhas finas. Em ambas as superfícies epidérmicas ocorrem um grande número de tricomas tectores e secretores. Três tipos de tricomas secretores foram observados: o tipo I, caracterizado por 1-2 células basais, pedículo de 2-3 células e uma cabeça secretora elíptica, constituída por 4-8 células; o tipo II, possui base e pedículo unicelular e cabeça bicelular globular; e o tipo III possui base, pedículo e cabeça esférica todos unicelulares. Os testes histoquímicos confirmaram a presença de óleos essenciais nos tricomas secretores e por todo o mesofilo; de polissacarídeos no tricoma glandular tipo II; e sugere a presença de proteínas na substância secretada pelos tricomas glandulares. As reações para detectar alcalóides, compostos fenólicos, amido e ligninas foram negativas. A presença de substâncias lipofílicas, dentre elas os óleos essenciais e as oleoresinas, evidencia a grande importância do gênero. A estrutura foliar segue os padrões relatados para a família, contudo, apresentando as características anatômicas relacionadas ao cultivo in vitro. Estes resultados podem contribuir para melhor compreensão do comportamento da espécie durante o processo de aclimatação.The genus Lippia (Verbenaceae) has great economical importance due to different applications of the essential oils present in several species occurring in Brazil. Lippia filifiolia Mart. & Schau. is an endemic species of the “Serra do Espinhaço”, Minas Gerais State, Brazil, and is considered as an endangered species. Following to the establishment and in vitro propagation of the species, it proved to be sensitive to the environmental changes that acclimatization process brings about. This way, the present study was conducted to evaluate histological and histochemical aspects of in vitro grown plants, and the influence of irradiance levels and growth regulators on in vitro culture performance of L. filifolia, aiming to obtain plants more tolerant to the acclimatization process. For anatomical studies leaf samples were characterized under photonic and scanning electron microscopy. The histochemical analyses were carried out using both fresh and hystoresin embedded samples. Apical segments were cultured onto a semi-solid MS-based medium supplemented with either NAA (0.1 mg L -1 ), BAP (0.5 mg L -1 ), and NAA (0.1 mg L -1 ) plus BAP (0.5 mg L -1 ), and submitted to three irradiance levels (40, 104, and 172 μmol m -2 s -1 ). Significant interactions between irradiance levels and culture were achieved for carotenoid content, plant height, average shoot number and leaf area. The contents of chlorophylls ‘a’ and ‘b’ were affected only by irradiance, lessening their concentrations with increasing irradiance levels. The growth regulator composition influenced the number and average size of the roots, the fresh mass of the aerial parts, and the anthocyanin concentration. For fresh and dry root weight and aerial fresh weight there was no interaction between irradiance levels and growth regulator combinations, although when analyzed isolated they influenced the measured characteristics. The irradiance levels did not affect carotenoid biosynthesis as revealed by carotenoid contents with increasing irradiance levels, suggesting that the species tolerates higher irradiance levels without any prejudice to the development, and may reflect possible positive effects during acclimatization. The leaf structure fits on the previously described pattern for the family, however, presenting thin cuticle and mesophyll size, large intercellular spaces, absence of supporting tissue, though consistent with those induced by in vitro conditions. In both epidermis surfaces there are a great number of tector and secretory trichomes. The latter presented three types: type I, formed by 1-2 basal cells, 2-3 pedicel cells, and an elliptical secretory head with 4-8 cells; type II, posses unicellular base and pedicel, and a globular bicellular head; type III, has base, pedicel, and a spherical head, all unicellular. The histochemical tests confirmed the presence of essential oils within secretory trichomes and spread throughout the mesophyll; polysaccharides in glandular trichomes type II; and suggest the presence of proteins in the secreted substance by glandular trichomes. The specific reactions for alkaloids, phenolic compounds, starch and lignins were negative. The presence of lypophilic substances, among them, essential oils and oleoresins, evidenced the great importance of the genus. The results may contribute for further work on acclimatization attempts of the species.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio