Purification and Antibacterial Activity of Synthesized Peptides During the Germination of Soybean Seeds (Glycine Max [L.] Merrill)

Peptídios antimicrobianos (AMPs) são produzidos por animais, plantas, insetos e outros organismos como estratégia de defesa eficiente, flexível, com consumo mínimo de energia e biomassa, em função de seu pequeno tamanho. Em vegetais, foram identificadas dez famílias de AMPs como parte da barreira constitutiva de defesa da planta, com massas moleculares que variam de 2 a 9 kDa. Este trabalho visou identificar e purificar peptídios de sementes de soja sintetizados durante a germinação e avaliar a atividade antibacteriana, com o objetivo de desenvolver defensivos agrícolas naturais e agentes antimicrobianos para as indústrias farmacêutica e veterinária. Sementes de soja da variedade UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) foram germinadas por 24, 48, 72 e 96 h, trituradas e maceradas em 2,5 volumes do tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0 contendo EDTA, PMSF e benzamidina. As sementes não germinadas foram moídas e adicionadas de tampão fosfato de sódio 25 mM na proporção de 1:5, contendo KCL, EDTA, tiouréia, PMSF e benzamidina. Os homogenatos de ambas foram mantidos sob agitação branda em geladeira por 2 h, centrifugados, e os sobrenadantes foram precipitados com sulfato de amônio. Cada sobrenadante foi aquecido a 80oC/15 min para precipitação diferencial de proteínas, e centrifugado. Seguiu-se cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-Sepharose com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,0, em equipamento tipo FPLC. O pool catiônico obtido foi submetido à cromatografia de troca catiônica em coluna CM-Sepharose com tampão MES 25 mM, pH 6,0, em equipamento tipo FPLC, e o pico eluído em 0,35 M de NaCl foi submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18-HPLC. Os perfis obtidos após cromatografia de fase reversa das sementes germinadas e não germinadas foram comparados para análise dos AMPs sintetizados durante a germinação. A semente germinada por 48 h mostrou duas regiões de síntese de diferentes proteínas. Foram realizados testes de atividade antimicrobiana utilizando o pool catiônico após troca aniônica e o pico eluído com 0,35 M de NaCl após troca catiônica, para as bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum (gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (gram- positiva), mostrando inibição parcial e total para os extratos após troca aniônica e catiônica, respectivamente. Paralelamente, análises de espectrometria de massa com os extratos obtidos após RP-HPLC indicaram a presença de peptídio de 1 a 9 kDa e de proteína de massa maior que 20 kDa, em regiões do perfil cromatográfico correspondentes à eluição em concentrações inferiores e superiores a 40% de acetonitrila, respectivamente. Outros picos peptídicos sintetizados durante a germinação por 48, estão sendo submetidos a análises de espectrometria de massa, seqüenciamento e testes antimicrobianos, visando selecionar peptídios efetivos contra fitopatógenos de interesse.Purification and Antibacterial Activity of Synthesized Peptides During the Germination of Soybean Seeds (Glycine Max [L.] Merrill). Adiver: Maria Cristina Baracat Pereira. Committee Members: Elizabeth Pacheco Batista Fontes and Reginaldo da Silva Romeiro. Antimicrobial peptídes (AMPs) they are produced by animals, plants, insects and other organisms as strategy of efficient, flexible defense, with minimum consumption of energy and biomass, in function of its small size. In plants, they were identified ten families of AMPs as part of the constituent barrier of defense of the plant, with molecular masses that vary of 2 to 9 kDa. This work aiming t to identify and to purify peptides of soybean seeds synthesized during the germination and to evaluate the antibacterial activity, objectifying the development of defensive agricultural natural and agents antimicrobial for the pharmaceutical and veterinary industries. Soybean of seeds of the variety UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) they were germinated by 24, 48, 72 and 96 h, triturated in the proportion of 1:2,5 using Tris-HCl buffer 0,1 M, pH 7,0 contends EDTA, PMSF and benzamidine. The no germinated seeds were triturated and added of phosphate of sodium buffer 25 mM in the proportion of 1:5, containing KCL, EDTA, thiourea, PMSF and benzamidine. . Both obtained extracts were maintained under agitation and ice-bath in refrigerator for 2 h, and centrifuged . As the first step of purification procedure, protein extracts were recovered after ammonium sulfate precipitation and centrifugation, heating up to 80oC/15 min for precipitation of proteins and a new centrifugation. Anion-exchange chromatography was followed in column DEAE-Sepharose using Tris-HCl buffer, 25 mM, pH 7.0 in equipment type FPLC. The obtained cationic pool was submitted to the cationic exchange cromatography in column CM Sepharose using MES buffer 25 mM, pH 6,0, in equipment type FPLC, and a fraction were recovered in NaCl 0,35 M, that was submitted to a C18- RP-HPLC. The obtained RP-HPLC profiles of the germinated and no-germinated seeds were compared each other and two different groups of proteins were observed when seeds were germinated by 48 h, if compared with no-germinated seeds, indicating expression of different proteins. Tests of antimicrobial activity were realized using the anionic-exchange pool and the cationic exchange-pool, against the plant pathogens Ralstonia solanacearum (Gram-negative) and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Gram-positive), showing partial- or full-inhibition, respectively . Simultaneously, analysis of mass spectrometry with the C18-RP-HPLC extracts shows peptides (1 to 9 kDa) and proteins (20 kDa in areas of the profile cromatography corresponding to the eluted in inferior and superior concentrations at 40% of acetonitrile). Other peptide fractions were submitted to the mass spectrometry analysis, amino acids-sequence determination, and antimicrobial test, aiming to select effective peptides to control important plant patogens of commercial interest.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerai