Development of biomolecular techniques for diagnosis of the porcine circovirus

O circovírus suíno (PCV) é um agente amplamente distribuído na Europa, América do Norte e sul da Ásia. O PCV é um pequeno vírus de cadeia simples de DNA (17 nm) que foi reconhecido, a partir da década de 90, como um patógeno de suíno. Dois tipos de PCV tem sido caracterizados e designados PCV tipo 1 (PCV1) e PCV tipo 2 (PCV2). O PCV1 foi primeiramente isolado em 1974 como um contaminante persistente da linhagem de células PK-15 de rim de suíno (ATCC CCL 31) e a cepa de PCV isolada de células PK-15 tem sido bem caracterizada. O PCV1 é considerado como um vírus não patogênico, enquanto que a infecção de um suíno pelo PCV2 é normalmente associada ao desenvolvimento de Síndrome Multissistêmica Pós-Desmame (PMWS), em animais de 5 a 12 semanas de idade, e ao tremor congênito (CT), que acomete animais no período neonatal. A PMWS é uma nova doença emergente de suínos, caracterizada clinicamente por dispnéia progressiva, aumento dos nódulos linfáticos e patologicamente caracterizada por uma ampla extensão de lesões inflamatórias. Recentemente, pesquisadores da EMBRAPA iniciaram um estudo da PMWS em leitões, mas no Brasil a presença do PCV ainda não é reconhecida oficialmente. O objetivo desse trabalho foi (1) padronizar técnicas de diagnóstico para o genoma e antígeno do PCV, assim como anticorpos contra o agente; (2) avaliar a susceptibilidade de diferentes linhagens celulares ao PCV; (3) diagnosticar a infecção do PCV em suínos da Zona da Mata de Minas Gerais; (4) isolar o PCV de amostras positivas. O PCV, proveniente de tecidos de animais normais e com diagnóstico de CT, foi isolado em células SK6 e analisadas por PCR. O padrão de bandas foi o mesmo encontrado em células PK15 contaminadas com PCV2, gentilmente cedidas pela EMBRAPA. Os oligos usados diferenciavam o PCV1 do PCV2. Todos os leitões de maternidade testados por PCR foram positivos para o PCV2. Porém, em 59 animais de abate testados por PCR não foi observada a presença do PCV. No teste de susceptibilidade as células PK15, SK6, VERO e MDCK foram susceptíveis ao PCV, mas somente as PK-15 estavam persistentemente infectadas. No ensaio de imunofluorescência indireta, foi utilizado um conjugado anti-IgG suína previamente padronizado e anticorpos contra PCV foram identificados em soros de 24 em 44 animais de abate testados e nenhum anticorpo foi encontrado nos animais com diagnóstico de CT positivos para PCV2 por PCR. Com esses resultados podemos concluir que os 24 suínos de abate soropositivos entraram em contato com o agente e desenvolveram a infecção em alguma fase durante o estagio de produção. A ausência de soropositivos entre os leitões recém nascidos, aliada a presença de infecção, pode ser explicada pela incapacidade de produção de anticorpos por esses animais neste estágio de desenvolvimento. Estudos adicionais da epidemiologia e da imunologia de infecções pelo PCV são necessários para o melhor entendimento e efetivo controle das doenças associadas a esse vírus.Porcine circovirus (PCV) is thoroughly an agent distributed in Europe, North America and south of Asia. PCV is a small virus of simple chain of DNA (17 nm) that was recognized, starting from the decade of 90, as a swine pathogen. Two types of PCV have been characterized and designated PCV type 1 (PCV1) and PCV type 2 (PCV2). PCV1 was isolated firstly in 1974 as a persistent contaminant of the lineage of cells PK-15 of swine kidney (ATCC CCL 31) and the stump of isolated PCV of cells PK-15 has been well characterized. PCV1 is considered as a non- pathogenic virus, while the infection of a swine for PCV2 is usually associated to Post weaning Multisistemic Wasting Syndrome (PMWS), in animals from 5 to 12 weeks of age, and to the congenital tremor (CT), that attack animals in the neonatal period. PMWS is a new emergent disease of swine, clinically characterized by progressive dispnea, increase of the lymphatic nodules and pathologically characterized by a wide extension of inflammatory lesions. Recently, researchers of EMBRAPA began a study of PMWS in pigs, but in Brazil the presence of PCV is not still recognized officially. The objective of that work was (1) to standardize diagnosis techniques for the genome and antigen of PCV, as well as antibodies against the agent; (2) to evaluate the susceptibility of different cellular lineages to PCV; (3) to diagnose the infection of PCV in swine of the Zona da Mata of Minas Gerais; (4) to isolate PCV of positive samples. PCV, originating from tissues of normal animals and with diagnosis of CT, it was isolated in SK6 cells and analyzed by PCR. The pattern of bands was the same found in contaminated cells PK15 with PCV2, kindly by EMBRAPA. The used oligos differentiated PCV1 of PCV2. All the pigs of maternity tested by PCR were positive for PCV2. However, in 59 slaughtering animals tested by PCR, PCV was not found. In susceptibility test, PK15, SK6, VERO and MDCK cells were susceptible for both PCV but only PK15 cells were persistently infected. Anti-PCV antibodies were found to be positive in 54,5% of slaughtering animals serum and any anti-PCV antibody was found in animals with clinical CT. Rapid and accurate diagnosis and removal of disease animals from farms, combined with good husbandry practices, would appear to be the only current method of controlling losses attributable to PCV2 infections. However, additional studies into the epidemiology and immunology of PCV infections are now required if better understanding and eventual control of the disease syndromes associated with these viruses are to be achieved.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio