Characterization of a soybean secretory protein and its interaction with BiP

Proteínas solúveis e de membrana da rota secretora são inicialmente endereçadas ao retículo endoplasmático (RE) e translocadas através da membrana deste. Em seguida, elas transitam através do Golgi para alcançar os compartimentos subcelulares e o meio extracelular. O RE mantém uma eficiente maquinaria de translocação, dobramento, associação, montagem de oligômeros e controle de qualidade de proteínas secretórias. A proteína BiP ("Binding Protein"), residente no RE, exibe atividade de chaperone molecular e participa ativamente neste processo por meio de interações proteína:proteína. Com o objetivo de identificar substratos potenciais de BiP, anticorpos contra frações microssomais isoladas da semente de soja foram usados para o escrutínio de uma biblioteca de expressão. Um clone de cDNA, denominado pUFVS64, que codifica uma proteína secretória, foi isolado e caracterizado. A proteína, codificada por pUFVS64 e denominada S-64, é sintetizada na semente de soja, em baixos níveis, e possui uma identidade de seqüência de 85% com uma proteína de membrana que se liga à sacarose, denominada SBP ("Sucrose Binding Protein"). Células intactas foram utilizadas para introdução de genes via eletroporação, ou biobalística, com o objetivo de aumentar a síntese da proteína S-64 em suspensões celulares de soja, de forma a aumentar a sensibilidade dos ensaios para determinação de associações entre as proteínas BiP e S-64.A associação entre BiP e S-64 foi avaliada, levando-se em consideração características bioquímicas diferenciadas, associadas com as referidas proteínas. Ensaios de sedimentação por afinidade, com o uso das resinas de ATP-agarose, GTP-agarose e ConA- sepharose, foram conduzidos, utilizando-se extratos de proteína total, de suspensões celulares de soja. Tanto S-64 quanto BiP são co-precipitadas por GTP-agarose, embora BiP não se associe com este nucleotídeo. A capacidade da resina GTP-agarose em sedimentar BiP reflete associação prévia entre BiP e uma proteína que liga GTP. Similarmente, ATP-agarose foi eficiente em co-sedimentar ambas as proteínas, embora apenas BiP se ligue diretamente à ATP. A sedimentação indireta de S-64 pela resina ATP-agarose demonstrou que S-64 estava a uma proteína que liga a ATP. A proteína S-64 é glicosilada e se liga diretamente a ConA-sepharose, enquanto BiP não se associa diretamente com concanavalina-A. Mesmo assim, BiP foi co-sedimentada indiretamente por ConA- sepharose. Coletivamente, estes resultados sugerem que S-64 interage com BiP, constituindo um substrato em potencial para caracterização de associações mediadas pela proteína BiP de plantas.Newly synthesized secretory and membrane proteins are synthesized on membrane-bound polysomes and co-translationally sequestered in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). These proteins then move to and through the Golgi complex where they are either secreted or sorted to subcelullar compartments. The ER keeps an efficient machinery for translocation, association, assembly of secretory proteins which functions as a quality control system of protein exit from this organelle. The ER-resident protein BiP (Binding Protein) exhibits a molecular chaperone activity and has been described as an important component of the quality control mechanism in the ER which is mediated by protein:protein interaction. In order to identify potential substrates for BiP, antibodies raised against membrane-enriched protein fractions from soybean seeds where used as a probe to screen a expression library. A cDNA clone, named pUFVS64, that encodes a secretory protein was isolated and characterized. The cDNA-encoded protein, designated S-64, is synthesized at low levels in soybean seeds and shares 85% sequence identity with the sucrose binding protein (SBP) which is a membrane-associated protein. In order to increase the sensitivity in the assays for detection of BiP:S-64 associations, the S- 64 cDNA was introduzed in soybean cultured cells by electroporation or a biolistic particle delivery system. The S-64:BiP association was evaluated taking advantage of the differential biochemical properties associated with the proteins. Affinity-precipitation assays, using ATP-agarose, GTP-agarose and ConA- sepharose resins, were performed with total protein extracts from soybean cultured cells. Both S-64 and BiP are co-precipitated by GTP-agarose, although BiP does not bind to GTP. The capacity of GTP-agarose to precipitate BiP reflects previous association between BiP and a GTP-binding protein. Likewise, the ATP-agarose resin co-precipitates efficiently both proteins, although just BiP binds ATP. The indirect precipitation of S-64 by ATP-agarose demonstrated that S-64 interacts with an ATP-binding protein. The S-64 protein is glycosylated and binds directly to ConA-sepharose, while BiP does not. However, the efficiency of BiP precipitation by ConA-sepharose was as high as of S-64 precipitation. Taken together, these results suggest that S-64 interacts with BiP and may be a potential substrate for the characterization of protein interactions mediated by plant BiP.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio