Identification of genes encoding potential effector proteins involved in the Hemileia vastatrix-coffee pathosystem

A ferrugem do cafeeiro é causada pelo fungo Hemileia vastatrix. Trata-se de um parasita biotrófico que infecta apenas o cafeeiro sendo responsável por grandes perdas na produção. Apesar da eficiência dos fungicidas, o emprego de cultivares resistentes é o melhor método de controle, sendo econômico, eficiente, além de não causar impactos ambientais. O grande desafio para os melhoristas é o surgimento de novas raças do patógeno capazes de suplantar a resistência das cultivares resistentes desenvolvidas. A raça XXXIII de H. vastatrix foi recentemente identificada no Brasil, infectando algumas cultivares resistentes à ferrugem do cafeeiro. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugem secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento (ou não) da colonização do parasita. Dessa forma, objetivou-se com esse trabalho, caracterizar genes que codificam proteínas secretadas pelo fungo, por meio de análises de bioinformática e de expressão temporal de genes, que podem funcionar como proteínas efetoras de H. vastatrix (raça XXXIII), a fim de auxiliar a compreensão do processo infeccioso do patógeno. Dentre os 615 genes candidatos a efetores, obtidos a partir de um genoma de referência do fungo, a grande maioria, 376 e 88, apresentaram similaridade com as proteínas de Puccinia sp e Melampsora larici-populina, respectivamente. Utilizando o software BLAST2GO, foi realizada a categorização funcional desses genes. A partir dos resultados do BLASTp, foram extraídos 310 termos GO, distribuídos em três categorias. A categoria mais representada foi “Função Molecular” com 137 termos, seguida por “Processos Biológicos”, 126 termos, e “Componente Celular”, 47 termos. De acordo com a anotação de Enzyme Codes (EC) obtida, as classes enzimáticas mais representadas foram as hidrolases, transferases e as oxidurredutases. Foram selecionados 13 genes para a análise de expressão temporal. A analise foi efetuada pela técnica de PCR em tempo real (RT-PCR), nos tempos 12, 24, 48 e 72 horas após a inoculação (hai) de urediniósporos frescos em plantas de cafeeiro resistente (CIFC 832-1) e suscetível (Caturra) à ferrugem. Foi possível obter quatro padrões diferentes de expressão. Tais padrões sugerem que os genes analisados possam estar envolvidos na tentativa de sobrevivência do fungo em resposta a resistência da planta, na fase biotrófica da infecção, além de genes relacionados com a supressão da resposta de defesa da planta durante a penetração, no reconhecimento do hospedeiro e/ou na fase inicial da colonização. Os resultados indicaram que pode ocorrer comunicação entre o fungo e o hospedeiro, logo no início da infecção, ainda na fase de germinação dos esporos. Estudos biológicos funcionais deverão ser realizados para determinar a verdadeira função desses efetores durante a interação de H. vastatrix com o cafeeiro. Essas informações são úteis para os estudos que visam o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na suplantação da resistência por novas raças do fungo, fornecendo subsídios para o desenvolvimento de cultivares com resistência durável.Coffee rust is caused by the fungus Hemileia vastatrix. It is a biotrophic parasite that infects coffee only, being responsible for major losses in production. Despite fungicides efficiency, the use of resistant cultivars is the best method of control, being economical, efficient, and does not cause adverse environmental impacts. The challenge for breeders is the emergence of new races of the pathogen able to overcome the resistance of developed resistant cultivars. The race XXXIII of H. vastatrix was recently identified in Brazil infecting some cultivars resistant to coffee rust. During the interaction with the host plant, coffee rust fungi secrete an arsenal of effector proteins which modify the structure and function of the host cell, allowing the establishment (or not) of parasite colonization. Therefore, this study aimed to characterize genes that encode proteins secreted by the fungus, by bioinformatics tools and temporal expression analysis of genes, which may function as an effector protein of H. vastatrix (race XXXIII), in order to understand the infection process of the pathogen. Amongst the 615 candidate effector genes, obtained from a fungal genome reference, the majority (376 and 88) has shown similarity to proteins of Puccinia sp and Melampsora larici- populina, respectively. Functional categorization of those genes was done using BLAST2GO software. Based on the results from BLASTp, 310 GO terms were found, distributed into 3 categories. The most representative category was “Molecular Function” with 137 terms, followed by “Biological Process”, 126 terms, and “Cellular Component”, 47 terms. According to the Enzyme Code (EC) annotation obtained, the most represented enzyme classes were hydrolases, transferases and oxidoreductases. 13 genes were selected for temporal gene expression analysis. The analysis was performed by Real-Time PCR technique, at 12, 24, 48 and 72 hours after inoculation (hai) of fresh urediniospores into resistant (CIFC 832-1) and susceptible (Caturra) coffee plants to rust. Four different expression patterns were found. Those patterns suggest that the genes analyzed may be involved in survival attempts ofthe fungus in response to the resistance of the plant, on biotrophic stage of infection, in addition to genes related to suppression of defense response of the plant during penetration, the host recognition and/or the early stages of colonization. The results indicate that communication may occur between the fungus and the host plant in early stage of infection, during the spore germination stage. Functional biological studies should be performed to determine the real function of these effectors during interaction between H. vastatrix and coffee plants. These information are useful for studies that aim at the understanding of molecular mechanisms involved in supplanting resistance by new races of the fungus, providing subsidies for the development of cultivars with durable resistance.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic