Use of fluorescent probes and assay of binding to the perivitelline layer of the chicken egg (Gallus gallus) for evaluate fresh and frozen-thawed dog (Canis lupus familiares) sperm

Análises seminais por meio da associação de sondas fluorescentes possibilitam a avaliação dos diversos compartimentos da célula espermática, simultaneamente, oferecendo um prognóstico mais acurado frente ao caráter subjetivo de alguns testes de rotina. Neste estudo foi utilizada a associação de três sondas fluorescentes com objetivo de avaliar a integridade da membrana plasmática (iodeto de propídio e Hoechst 33342) e o potencial de membrana mitocondrial (MitoTracker red), em sêmen fresco e descongelado de cão. Os resultados obtidos foram comparados aos resultados dos testes de rotina. Todos os testes demonstraram capacidade em detectar queda de qualidade seminal pós- descongelamento. A associação das sondas fluorescentes iodeto de propídio (IP), Hoechst 33342 (H33342) e MitoTracker red (CMXRos) mostrou-se eficaz na distinção de diferentes populações de espermatozoides em ejaculados descongelados de cão doméstico. Foram distintas 4 populações: IC (membrana plasmática íntegra e com potencial de membrana mitocondrial), IS (membrana plasmática íntegra e sem potencial de membrana mitocondrial), LC (membrana plasmática lesada e com potencial de membrana mitocondrial) e LS (membrana plasmática lesada e sem potencial de membrana mitocondrial). Esta associação permitiu também quantificar e qualificar as injúrias causadas às membranas plasmáticas das células espermáticas, pelo processo de congelamento/descongelamento, nesta espécie. Foi observada correlação (p<0,05) entre a coloração das sondas fluorescentes e a avaliação da motilidade espermática e teste hiposmótico. Desta forma, sugere-se a inclusão da combinação de sondas fluorescentes nos protocolos de análise de sêmen, como teste complementar aos testes convencionais, tornando mais precisa a avaliação das injúrias à célula espermática desta espécie. Entretanto, nem os testes de rotina e nem as sondas fluorescentes são hábeis em predizer a capacidade do espermatozoide de ligar-se ao ovócito, evento crucial para a fecundação. Assim, faz-se importante a adoção de testes de ligação entre espermatozoides e ovócitos nas pesquisas referentes à avaliação dos protocolos de congelamento/descongelamento do sêmen. Embora o status metabólico dos ovócitos, assim como o efeito fêmea, limitem a exatidão das interpretações, tem-se buscado substratos de ligação mais homogêneos e de mais fácil obtenção. Neste contexto, a membrana perivitelina do ovo de galinha (MPOG) tem se demonstrado eficiente na avaliação da capacidade de ligação do sêmen em diversas espécies. O teste de ligação de espermatozoides à MPOG apresenta comportamento semelhante aos resultados dos testes de rotina da avaliação do sêmen, assim como os testes com as sondas fluorescentes, apresentando diferença quando comparados sêmen fresco e sêmen descongelado (p<0,05). Neste estudo, o teste hiposmótico correlacionou-se positivamente com o número de espermatozoides ligados à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha. O comportamento da MPOG e das sondas, entre os tratamentos, demonstraram sensibilidade da membrana em distinguir sêmens de diferentes potenciais de ligação (p < 0,05) nesta espécie.Seminal analysis by means of the association of fluorescent probes allows for the simultaneous evaluation of several compartments of the spermatic cell, offering a more accurate prognostic when compared to the subjective character of some routine tests. In this study, the association of three fluorescent probes was used with the goal of evaluating the integrity of plasma membrane (propidium iodide and Hoechst 33342) and mitochondrial membrane potential (Mito Tracker red), in dog semen, both fresh and frozen. The attained results were compared to those of routine tests. All tests showed the capacity of detecting a drop in seminal quality after being unfrozen. The association of the fluorescent probes propidium iodide (IP), Hoechst 33342 (H33342) and Mito Tracker red (CMXRos) showed efficiency when differentiating sperm populations in the frozen semen of domestic dogs. There were four distinct populations: IC (intact plasma membrane and with mitochondrial membrane potential), IS (intact plasma membrane without mitochondrial membrane potential), LC (injured plasmatic membrane with mitochondrial membrane potential) and LS (injured plasmatic membrane without mitochondrial potential). This association also allows the quantification and qualification of the injuries caused on the sperm cell by the freezing/thawing process in this species. A correlation was observed between the coloring of the fluorescent probe and the evaluation of sperm motility and hypo- osmotic swelling test (p<0,05). However, the attained results with the probes showed a higher precision rate when detecting injuries to the spam cells thus suggesting the inclusion of the combination of fluorescent probes in semen analysis protocols, once evidence shows greater efficiency when compared to routine tests. Consequently, the inclusion of the combination of the fluorescent probes in the semen analysis is suggested as a complementary test, making the evaluation of the injuries to the spermatic cell of this species more precise. However, neither the routine tests nor the fluorescent probes are capable of predicting spermatozoon’s capability to bind to the oocyte, an crucial event to fecundation. Therefore, it is important to introduce biding assays between spermatic cells and oocytes in the research that refer to the evaluation of the freezing/ thawing semen protocols. Although the oocytes metabolic status, like the ‘’female effect’’, limit the accuracy of the interpretations, substrate binding that are more homogeneous and easier to obtain are being pursued. In this context, the perivitelline layer of the egg yolk has demonstrated to be efficient in evaluating the binding capacity of sperm in a number of species. The binding tests of sperm to the MPOG shows a behavior that is similar to the results obtained from semen’s routine evaluation tests, as well as the test with the fluorescent probes, presenting a difference when comparing fresh with unfrozen semen (p<0,05). In this study, the hypoosmotic test correlated positively to the number of spermatozoon connected to the perivitelline layer of the egg yolk. The behavior the MPOGs and that of the probes, between other treatments, demonstrated the membrane’s sensibility in distinguishing semen of different potential binding (p