Silencing of myo-inositol-phosphate synthase via RNAi in tomato and its influence on morpho-physiology of the vegetative and reproductive body, and metabolic profile of primary and cell wall

A enzima mio-inositol-1-fosfato sintase (MIPS1) (E.C.5.5.1.4) catalisa a conversão irreversível de D-Glicose-6-P para 1-L-mio-inositol-1-P. O mio-inositol desempenha papel de destaque no metabolismo vegetal, fornecendo inositol e inositídeos em processos metabólicos essenciais à formação do vegetal. Dentre as várias vias nas quais o mio-inositol está envolvido algumas são alvo do melhoramento vegetal, a exemplo a manipulação do conteúdo de ácido fítico e de oligossacarídeos em sementes e açúcares estruturais na parede celular. Até o presente momento, plantas MIPS silenciadas não foram caracterizadas em detalhes, principalmente em suas estruturas vegetativas. Com isso, o presente trabalho objetivou caracterizar tomateiros ‘Moneymaker’ com diferentes níveis de silenciamento de MIPS1. Para a indução do silenciamento utilizou- se tranformação genética via Agrobacterium tumefaciens contendo plasmídeo pCambia com construção tipo intron hairpin de fragmentos do gene MIPS de Glycine max (∆GmMIPS) sob controle do promotor CaMV 35S. Avaliou-se o efeito do silenciamento de MIPS1 em plantas transgênicas matrizes T0 e progênies T1 e T2 quanto ao desenvolvimento de frutos e sementes, conteúdos de ácido fítico, açúcares, pigmentos fotossintéticos, respostas fisiológicas mediante a avaliação das trocas gasosas, fluorescência da clorofila a, atividade de enzimas do estresse oxidativo e caracterização do perfil metabólico e constituintes de parede celular. Os resultados apontaram eficiência da construção transgênica na indução do silenciamento. O silenciamento ocasionou redução do conteúdo de ácido fítico em sementes, redução da quantidade de sementes por fruto e redução no desenvolvimento do fruto; redução na germinação e desenvolvimento de plântulas provindas de sementes normais nas progênies T0 e T1. O silenciamento também ocasionou alterações no conteúdo de açúcares, em folhas e sementes nas progênies T0 e T1 e reduziu a firmeza da epiderme e do pericarpo em frutos da progênie T1. Tal redução na firmeza pode estar relacionada à composição ou estrutura das paredes celulares; porém não foram identificadas reduções no conteúdo de açúcares de parede celular e celulose em pericarpos e folhas de plantas T2, mas sim acumúlo de ácidos urônicos, tanto em pericarpo quanto em folhas. Em relação ao aparato fotossintético, o silenciamento não causou alterações. O conteúdo de pigmentos fotossintéticos, parâmetros de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a foram semelhantes aos apresentados pelas plantas não transformadas, Outra evidência que o silenciamento de MIPS não causa distúrbios no corpo vegetativo foi a atividade de enzimas do estresse oxidativo que, em condições ótimas, não apresentou diferenças. As alterações encontradas no corpo vegetativo tiveram estreito envolvimento com o metabolismo de inositol, como conteúdo de açúcares (glicose-6P, glicose e sacarose) em horários de intensa atividade fotossintética. A metabolômica possibilitou uma análise mais integrativa em que ficou evidenciada a redução de alguns aminoácidos, acúmulo de açúcares e redução de açúcares alcoóis, todos estreitamente relacionados ao metabolismo de inositol em folhas. Em frutos, verificou-se influência mais expressiva da MIPS, com alterações em todas as quatro idades avaliadas (10, 15, 50 e 60 dias após a antese), tanto no pericarpo quando nas sementes. O maior número de alterações foi encontrado nas sementes, caracterizadas pela redução do conteúdo de aminoácidos, de intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA), de ácidos orgânicos e de açúcares alcoóis. Os açúcares, por sua vez, apresentaram comportamento variado, dependendo da sua relação com o metabolismo de inositol, onde a frutose e a trealose apresentam acúmulo, enquanto a glicose e a sacarose apresentam padrão mais variado em decorrência do envolvimento em uma rede mais complexa de regulação. Em pericarpos, o perfil metabólico foi respondente as variações de desenvolvimento, porém apresentando alterações no conteúdo de açúcares. Com esse estudo podemos afirmar que a construção tipo intron hairpin de fragmentos do gene MIPS de Glycine max (∆GmMIPS), sob controle do promotor CaMV 35S, ocasiona silenciamento em tomateiros e as plantas silenciadas tiveram o conteúdo de metabólitos influenciados pelo conteúdo de mio-inositol ou expressão da MIPS alterado, tanto na parte vegetativa quanto na reprodutiva. Registra-se, também, que o silenciamento de MIPS não foi capaz de alterar a atividade fotossintética ou causar direta ou indiretamente estresse oxidativo no corpo vegetativo em plantas MIPS silenciadas.Myo-inositol phosphate synthase (MIPS1) (E.C.5.5.1.4) catalyzes the irreversible conversion of D-Glucose-6-P to 1-L-myo-inositol-1-P. Myo-inositol plays an important role in plant metabolism, providing inositides and inositol for essential metabolic processes in the formation of the vegetative and reproductive plant body. Among the pathways in which the myo-inositol is closely involved, some are target of plant breeding, such as genetic manipulation of phytic acid and oligosaccharides contents in seeds and structural sugars in the cell wall. To date, MIPS silenced plants have not been characterized in detail, especially in their vegetative structures. Thus, the present study aimed to characterize tomato 'Moneymaker' with different levels of silencing MIPS1. For induction of gene silencing was used transformation via Agrobacterium tumefaciens containing the plasmid pCambia with construct intron-hairpin-RNA type whith MIPS gene fragments of Glycine max (ΔGmMIPS) under control of the CaMV 35S. The effect of MIPS1 silencing in primary transgenic plants T0 and T1 and T2 progenies was evaluated for the development of fruit and seeds, phytic acid and sugar contents, photosynthetic pigments, physiological responses by evaluating gas exchange, chlorophyll a fluorescence, oxidative stress enzyme activity, metabolic profile characterization and cell wall constituents. The results showed the efficiency of the transgenic construct to induce silencing. The silencing resulted in reduction of phytic acid content in seeds, reducing the amount of seeds and a reduction in fruit development, reduction in germination and seedling development stemmed from normal seeds in T0 and T1 progeny. The silencing also induced changes in the content of sugars in leaves and seeds in T0 and T1 progeny and reduced firmness of the epidermis and pericarp in fruits of T1 progeny. This decrease in firmness may be related to the composition or structure of cell walls, but no reductions were identified in the content of sugars and cellulose in cell wall pericarp and leaves of T2 plants, but accumulation of uronic acids, both in pericarp as sheets. In relation to the photosynthetic apparatus, silencing caused no changes. The content of photosynthetic pigments, gas exchange parameters and chlorophyll fluorescence were similar to those presented by the non- transformed plants, Further evidence that silencing of MIPS does not cause disturbances in the vegetative body was the activity of enzymes of the oxidative stress that in optimal conditions, showed no differences. However, the changes found in the vegetative body had close involvement with the metabolism of inositol, as content of sugars (glucose- 6P, glucose and sucrose) in times of intense photosynthetic activity. The metabolomics allowed a more integrative analysis in which there is an evident reduction of some amino acids, accumulation of sugars and sugar alcohols reduction, all closely related to the metabolism of inositol sheets. In fruits, there was more significant influence of MIPS, with changes in all four ages evaluated (10, 15, 50 and 60 days after anthesis), both when the seed pericarp. The largest number of changes were found in the seeds, characterized by the reduction of the content of amino acids, intermediates of the citric acid cycle (TCA), organic acids and sugar alcohols. Sugars, in turn, showed varied behavior depending on their relationship with the metabolism of inositol, where fructose and trehalose accumulation feature, while glucose and sucrose have more varied pattern as a result of being involved in a more complex regulatory network. In pericarp, the metabolic profile was respondent variations in development, but with alterations in sugar content. With this study we can see that the construction type intron hairpin fragment of MIPS Glycine max (ΔGmMIPS) gene under control of the CaMV 35S promoter, causes silencing in tomato plants were silenced and content of metabolites influenced the content of myo-inositol or altered expression of MIPS, both in vegetative and in reproductive part. Join also the silencing of MIPS was not able to change the photosynthetic activity or directly or indirectly cause oxidative stress in the vegetative body MIPS-silenced plants.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerai