Perivascular mesenchymal stem cells of the umbilical cord of dogs: harvesting, cultivation and characterization

A popularidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) vem desde a descoberta de células aderentes, com formato fibroblastoide e capazes de se auto-renovar, formar colônias, além de originar diferentes tecidos como cartilagem, osso, gordura e músculos, sendo então objeto de estudos principalmente na medicina regenerativa. Diante disso, há uma busca constante por fontes de MSCs, sendo a medula óssea a principal fonte dentro da terapia celular, no entanto, rejeição, co-morbidades associadas a coleta e número limitado de doadores estimularam a busca por novas fontes deste tipo celular. O objetivo desse trabalho é descrever a obtenção, o cultivo e a caracterização de células obtidas a partir da digestão enzimática do tecido perivascular do cordão umbilical (UC) de cães, na esperança de estabelecer uma nova fonte deste tipo celular para as espécies canina e humana, através do modelo animal. Para isso, UCs obtidos a partir de cesarianas terapêuticas foram submetidos ao protocolo de digestão enzimática com colagenase e hialuronidase. As células obtidas a partir desse procedimento foram submetidas a três diferentes protocolos de cultivo a fim de estabelecer o melhor meio para esse tipo celular. Estabelecido o melhor meio, através da curva de crescimento e do tempo de duplicação, as células foram submetidas a ensaios de diferenciação para comprovação de sua multipotência. Foram obtidas culturas aderentes e com morfologia fibroblastoide a partir de todos os UCs utilizados, com um número inicial de células de 4,8x105 por UC. A curva de crescimento mostrou uma fase estacionária (lag) de 0 a 24 horas, seguida por uma fase de crescimento de 24 a 168 horas e, então, uma fase de decaimento celular. O tempo de duplicação foi mantido em torno de 15 horas até a sexta passagem, a partir do qual houveram indícios de senescência celular. O ensaio de diferenciação demonstrou a capacidade das células em diferenciar-se em osteoblastos, condrócitos e adipócitos quando submetidos aos meios de indução. Diante dos resultados, acredita-se que as células obtidas a partir do tecido perivascular dos vasos sanguíneos do cordão umbilical de cães após sua digestão enzimática sejam células-tronco, com potencial de uso na terapia celular, necessitando da comprovação de linhagem mesenquimal.The popularity of mesenchymal stem cells (MSCs) comes from the discovery of adherent cells with fibroblastic shape, ability of self-renewal, form colonies and give rise to different tissues such as cartilage, bone, fat and muscle, therefore is the object of studies mainly in regenerative medicine. There is a constant search for sources of MSCs, with the bone marrow being the major source for cell therapy. However, rejection, co- morbidities associated with collection and limited number of donors stimulated the search for new sources of this cell type. The aim of this paper is to describe the harvesting, culture and characterization of cells obtained from enzymatic digestion of dogs umbilical cord perivascular tissue, hoping to establish a new source of this cell type to canine and human species through the animal model. For this, umbilical cords (UCs) obtained from therapeutic caesarean section were submitted to the protocol of enzymatic digestion with collagenase and hyaluronidase. Cells obtained from this procedure were subjected to three different protocols of culture in order to establish the best medium to that cell type. Established the best media through the growth curve and doubling time, cells were tested for differentiation as evidence of their multipotency. Adherent cells with fibroblastic shape were obtained from all UCs used, with an initial cell number of 4.8 x10 5 by UC. The growth curves showed a lag from 0 to 24 hours, followed by a phase of growth of 24 to 168 hours, and then a mobile phase of decay. The doubling time was kept around 15 hours until the sixth passage, from which there were signs of cellular senescence. The differentiation assay demonstrated the ability of cells to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes when subjected to the induction means. Given the results, it is believed that the cells obtained from the perivascular tissue of the blood vessels of the umbilical cord of dogs after enzymatic digestion are stem cells, with potential uses in cell therapy, requiring that their mesenchymal lineage is proven