Real-time PCR plant health diagnostics: basic requirements for method validation

O setor agropecuário brasileiro vem exigindo políticas e serviços públicos cada vez mais ágeis e eficazes a fim de aumentar sua competitividade em uma economia globalizada. Diante desse desafio, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA vem buscando inovar e aprimorar continuamente a qualidade dos seus processos e serviços a fim de atender satisfatoriamente as crescentes demandas do setor produtivo e da sociedade brasileira. Dentro da área laboratorial do MAPA, o aprimoramento dos processos e serviços prestados foi acelerado com a exigência da implantação de sistemas de gestão da qualidade competência de laboratórios de ensaio e calibra credenciados, bem como a acreditação dos mesmos junto ao INMETRO. Nesse processo, a validação de métodos de ensaio é um requisito técnico importante uma vez que pode afetar diretamente a qualidade dos resultados. A falta de diretrizes que indiquem os principais fatores a serem verificados nas validações de métodos de diagnóstico fitossanitário por PCR em tempo-real (qPCR) juntamente com a falta de padronização das publicações científicas que tratam do tema vêm dificultando a validação adequada desse tipo de método. A qPCR é uma técnica de biologia molecular que vem sendo largamente utilizada na detecção e identificação de diversos fitopatógenos por sua rapidez, seletividade, sensibilidade, ampla faixa dinâmica de quantificação e possibilidade de automação das análises. No entanto, alguns fatores podem impactar negativamente a qualidade dos ensaios, tais como: a qualidade do DNA extraído, a presença de inibidores de PCR nas amostras, a qualidade dos iniciadores e sondas utilizados, dentre outros. Por esse motivo, alguns países e blocos econômicos têm regulado a implantação da norma ISO/IEC 17025 e a validação de métodos de detecção e identificação de fitopatógenos por técnicas moleculares. Dentre os principais parâmetros a serem observados nas validações deviii métodos de PCR destacam-se: repetibilidade e reprodutibilidade. sensibilidade, seletividade, especificidade,repetibilidade e reprodutibilidade.The Brazilian agribusiness sector has been demanding more agile and efficient policies and public services in order to increase its competitiveness in a globalized economy. Confronted by this challenge, the Ministry of Agriculture, Livestock and Foodsupply - MAPA has been trying to innovate and continually improve the quality of its processes and services in order to respond to the growing demands of the productive sector and of the Brazilian society. In the laboratory field, MAPA has been demanding that its official and approved laboratories implement quality management systems in conformity with the General requirements for the Brazilian National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO). In this process, method validation is a key technical requirement since it can directly affect the quality of the analytical results. The lack of guidelines which indicate the main parameters to be checked in the validation of plant diagnostic methods by real-time PCR (qPCR) and the lack of consensus in the scientific literature have been compromising proper validations of this kind of method. The qPCR is a molecular biology technique which has been extensively used in the detection and identification of plant pathogens due to its rapidity, selectivity, sensibility, broad dynamic range and automation capabilities. However, some factors may impact the quality of qPCR results, such as: DNA quality, PCR inhibitors, primer and probe quality, etc. Thus, some countries and trade blocs have been regulating the implementation of the ISO/IEC 17025 standard and the validation of molecular diagnostic methods for the detection and identification of plant pathogens. The main parameters to be checked in the validation of PCR methods are: sensibility, selectivity, specificity, repeatability and reproducibility