Effect of different cooling rates, equilibration times and permeating cryoprotectants on deep-freezing of buck spermatozoa

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes protocolos de resfriamento, tempos de equilíbrio e crioprotetores permeáveis sobre as características de motilidade e integridade de membrana de espermatozóides caprinos criopreservados. Para tal, foram delineados três experimentos. No experimento 1, avaliou-se o efeito de diferentes protocolos de resfriamento sobre a criopreservação de sêmen caprino. Um total de 20 ejaculados de bodes das raças Saanen (n = 2) e Alpina (n = 2) foram congelados utilizandose um meio à base de leite desnatado-gema, acrescido de 5% de glicerol. Alíquotas do sêmen, então, diluído, foram resfriadas até 5 °C, utilizando dois protocolos de resfriamento diferentes (PR1; média de -0,12 °C/min e PR2; média de -0,4 °C/min), antes de serem congeladas em nitrogênio liquido. O sêmen foi avaliado quanto à sua motilidade espermática progressiva, vigor, taxa de recuperação da motilidade, resposta ao teste hiposmótico (HOST) e coloração. Nesse experimento, a curva de resfriamento PR2 promoveu uma melhor proteção aos efeitos causados pelo choque térmico durante a criopreservação do sêmen caprino, que a curva PR1. No experimento 2, avaliou-se o efeito de dois períodos de equilíbrio sobre as características de motilidade e integridade de membrana de espermatozóides caprinos criopreservados. Um total de 20 ejaculados de animais da raça Saanen (n = 2) e Alpina (n = 2) foram congelados utilizando-se um meio à base de leite desnatado-gema, acrescido de 5% de glicerol. Alíquotas do sêmen diluído foram, então, resfriadas segundo Fürst (2002), e mantidas a temperatura de 5 °C, por um período de 15 minutos (TE1) ou 75 minutos (TE2) antes de serem congeladas em nitrogênio liquido. O sêmen foi avaliado quanto à sua motilidade espermática progressiva, vigor, resposta ao teste hiposmótico (HOST), ao teste supravital e ao teste de termorresistência (TTR), antes e após o congelamento. Nesse experimento, o tempo de equilíbrio de 75 minutos promoveu uma melhor criopreservação do sêmen caprino que o tempo de equilíbrio curto, de 15 minutos. No experimento 3, avaliou-se o efeito do glicerol e etileno glicol sobre a criopreservação de sêmen caprino, por meio de análises in vitro do sêmen. Um total de 20 ejaculados de animais da raça Saanen (n = 2) e Alpina (n = 2) foram congelados utilizando-se um meio à base de leite desnatado-gema, acrescido de 5% de glicerol. Alíquotas do sêmen diluído foram, então, resfriadas, utilizando-se a metodologia descrita por Fürst (2002). O sêmen foi avaliado quanto à sua motilidade espermática progressiva, vigor, resposta ao teste hiposmótico (HOST), ao teste supravital e ao teste de termorresistência (TTR), antes e após o congelamento. Nesse experimento, o uso do EG como crioprotetor permeável promoveu uma melhor proteção à viabilidade da célula espermática, durante o processo de criopreservação, que o glicerol. Em conclusão, o uso do protocolo de resfriamento 2, associado a um período de equilíbrio de 1 hora e ao uso do etileno glycol, promoveu uma melhor proteção das características de motilidade e integridade de membrana, aumentando a viabilidade dos espermatozóides caprinos congelados.The aim of this study was to evaluate the effect of different cooling rates, equilibration times and permeating cryoprotectants on motility characteristics and plasma membrane integrity of cryopreserved goat spermatozoa. Three experiments were designed. In the first one was evaluated the effect of different cooling methods on goat semen cryopreservation. A total of 20 ejaculates from Saanen (n = 2) and Alpine (n = 2) goats were frozen using a standard dry skim milk yolk diluent with 5% glycerol. Aliquots of the extended semen were then cooled using two different cooling methods (PR1; Becker or PR2; Fürst, 2002), before being frozen in liquid nitrogen. The semen was evaluated by total motility, vigor and the response to hypoosmotic solution test (HOST), live/dead stain and thermo-resistance test (TRT), before and after thaw. In this experiment the cooling method PR2 protected cell viability better them PR1 during the criopreservation process, reducing cold shock damage and improving the cryosurvival of goat spermatozoa. In the second experiment was evaluated the effect of different equilibration times on motility characteristics and plasma membrane integrity of cryopreserved goat spermatozoa. A total of 20 ejaculates from Saanen (n = 2) and Alpine (n = 2) goats were frozen using a standard dry skim milk yolk diluent with 5% glycerol. Aliquots of the extended semen were then cooled using the cooling methodology described by Fürst (2002) and remained at the temperature of 5-4 °C by a period of 15 minutes (TE1) or 75 minutes (TE2). The semen was evaluated by total motility, vigor and the response to hypoosmotic solution test (HOST), live/dead stain and thermoresistance test (TRT), before and after thaw. In this experiment the equilibration time of 75 minutes protected the cell viability better than the period of 15 minutes during the criopreservation process, improving the cryosurvival of goat spermatozoa. In the third experiment was evaluated the effect of the glycerol (G) and ethylene glycol (EG), on motility characteristics of cryopreserved goat spermatozoa by the in vitro semen analyses. A total of 20 ejaculates from Saanen (n = 2) and Alpine (n = 2) goats were frozen using a standard dry skim milk-yolk diluent with 5% glycerol. Aliquots of the extended semen were then cooled using the cooling methodology described by Fürst (2002). The semen was evaluated by total motility, vigor and the response to hypoosmotic solution test (HOST), live/dead stain and thermo-resistance test (TRT), before and after thaw. In this experiment EG promoted a better protection of the spermatic cell viability during the cryopreservation than the G. In conclusion the use of the cooling method PR2 associated with the one hour equilibration period and the ethylene glycol improved the motility characteristics and integrity of plasma membrane, increasing the number of viable goat spermatozoa after cryopreservation.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic