Molecular characterization of soybean cultivars by a fluorescent genotyping system using microsatellite markers with a universal tail extension

O desenvolvimento de sistemas de identificação molecular para determinar e rastrear a identidade genética de um cultivar representa um grande desafio ao sistema de proteção utilizado no país, até então fundamentado em descritores fenotípicos. A identificação de cultivares de soja é feita atualmente no Brasil com base em 30 descritores morfológicos. Marcadores moleculares do tipo microssatélite são largamente utilizados para fins de determinação da diversidade genética, paternidade, análises de pureza varietal e mapeamento genético. Algumas variações da técnica de genotipagem convencional por microssatélite vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de adequar a velocidade e automatização de técnicas atuais, com qualidade de análise e baixo custo. Dentre elas, destaca-se um sistema multiplex de genotipagem em sequenciador semi-automático de DNA, que utiliza primers com cauda estendida universal (PCEU). O presente trabalho teve como objetivos padronizar um sistema reprodutível de genotipagem molecular semi-automatizado baseado na metodologia PCEU para a cultura da soja, avaliar diferenças em relação ao sistema de genotipagem convencional, em gel de poliacrilamida e caracterizar com o conjunto de marcadores selecionados, 30 cultivares de soja estimando suas frequências alélicas. Estes descritores genotípicos poderão ser utilizados como ferramenta para a identificação de cultivares e fornecer subsídios para a proteção da propriedade intelectual, determinação e comprovação de pureza varietal. Foram utilizados 30 cultivares comerciais de soja avaliados com um grupo de 22 marcadores microssatélites já descritos na literatura. A genotipagem foi realizada em sequenciador semi- automático (PCEU) e em gel de poliacrilamida (convencional). Dentre os locos analisados, 13 foram selecionados por apresentarem melhor perfil de amplificação, menos produtos stutter, e maior número de alelos. O perfil alélico de cada cultivar foi definido primeiramente em sistema tradicional de genotipagem por eletroforese em gel de poliacrilamida, e depois no sequenciador semi-automatizado. Para a metodologia de genotipagem PCEU, o número total de alelos encontrados foi de 50, variando de 2 (Satt045) a 7 (Satt005). O conteúdo de informação polimórfica (PIC) variou de 0,40 (Satt045) a 0,74 (Satt005) com média de 0,62. Para a metodologia convencional o número de alelos encontrados foi de 38 com uma variação de 2 (Satt045, Satt070 e AF162283) a 5 (Satt005) alelos. O PIC apresentou uma faixa 0,39 (Satt045) a 0,67 (Satt079), com média de 0,56. Os valores de probabilidade de identidade ao acaso diferiram entre os métodos, sendo <10-5 (PCEU) e <10-4 (Convencional). Apesar de diferenças pontuais, observou-se alta correlação entre as matrizes de dissimilaridade genética entre os métodos (0,8026), e os grupos formados apresentaram também alta similaridade e foram concordantes com dados fenotípicos de registro varietal e de genealogia. Além da alta sensibilidade na detecção de alelos de tamanhos muito próximos, o método PCEU permitiu uma identificação mais criteriosa dos artefatos de amplificação. Os grupos de marcadores selecionados em ambas as metodologias permitiram distinguir todas as cultivares analisadas. O método PCEU possui baixo custo quando comparado a técnicas comuns de marcação por fluorescência, além disso, sua alta precisão faz deste um método vantajoso para a caracterização de cultivares e determinação da pureza genética. O grupo de marcadores analisados pode ser usado como um conjunto de descritores genotípicos complementar aos descritores fenotípicos obrigatórios utilizados para fim de proteção de cultivares em testes de distinguibilidade.Identification of soybean cultivars in Brazil is currently based on 30 morphological descriptors. Microsatellite markers are widely used for determination of genetic diversity, paternity tests, varietal purity and genetic mapping. Some variations of the conventional technique for microsatellite genotyping have been developed in order to match the speed and automation of current techniques with quality and low cost. Among them, there is a multiplex genotyping system in semi-automatic DNA sequencers, using universal tail extended primers (UTEP). This study aimed to standardize a robust system of semi-automatic molecular genotyping based on the UTEP methodology for soybean identification, to evaluate differences between this method and the conventional genotyping system using polyacrylamide gel electrophoresis and to characterize 30 soybean cultivars with a set of selected markers, estimating their allelic frequencies. These descriptors can be used as genotypic tool for cultivar identification and provide subsidies for the protection of intellectual property, determination and testing of varietal purity. Thirty commercial soybean cultivars were evaluated with a group of 22 microsatellite markers described in the literature. Genotyping was performed in a semi-automatic sequencer (UTEP) or by polyacrylamide gel electrophoresis (conventional). Among the loci analyzed, 13 were selected because they presented good amplification profiles, with few stutter products, and a large number of alleles. The allelic profile of each cultivar was first defined by the genotyping conventional system, and then by the semi- automated sequencer. For the UTEP genotyping methodology, the total number of alleles found was 50, ranging from 2 (Satt045) to 7 (Satt005). The polymorphic information content (PIC) ranged from 0.40 (Satt045) to 0.74 (Satt005) with an average of 0.62. For the conventional method the number of alleles found was 38 with a range of 2 (Satt045, Satt070 and AF162283) to 5 (Satt005) alleles. The PIC had a range 0.39 (Satt045) to 0.67 (Satt079), with an average of 0.56. The values of probability for random identity differed between the methods being <10-5 (UTEP) and