Modification of the fast method of Scharer for detection, with high sensitivity, of the residual alkaline phosphatase in butter

A fosfatase alcalina (ALP) é uma enzima naturalmente presente no leite. Suas concentrações variam de acordo com a raça do animal, alimentação, período de lactação, produtividade e ao longo das estações do ano. A ALP é inativada pelas temperaturas de pasteurização, assim, a avaliação da atividade residual desta enzima é utilizada na indústria de laticínios para determinar a eficiência do tratamento térmico aplicado aos produtos lácteos. Todavia, trabalhos sobre a atividade desta enzima em manteiga são escassos, principalmente no Brasil, onde esta análise não é um procedimento obrigatório na avaliação da qualidade de manteiga, como ocorre nos Estados Unidos e em países da Europa. De acordo com a Food and Drug Administration (FDA), o limite máximo permitido de atividade residual da ALP em leite e produtos lácteos pasteurizados é de 350,0 mU/Kg de produto, pelo método fluorimétrico. Neste trabalho, os valores médios encontrados para a atividade desta enzima no creme cru padronizado (entre 40,0 e 41,0% de gordura) durante o verão, o outono e o inverno, pelo método fluorimétrico, foram de 17.264.214 + 2.554.645, 17.719.500 + 5.476.910 e 14.196.714 + 1.375.055 mU/L, respectivamente. Foram analisadas amostras de manteigas comerciais quanto às quantidades residuais da ALP, avaliou-se a sensibilidade e o limite de detecção do método rápido de Scharer, visual e espectrofotométrico, em comparação com o método fluorimétrico e modificou-se o método rápido de Scharer, obtendo-se uma nova metodologia, de alta sensibilidade e de custo mais acessível para determinação da atividade residual da ALP em manteiga. Dentre as vinte amostras de manteigas comerciais analisadas, quatro (20%) apresentaram resultado positivo para atividade residual da ALP, sendo duas da marca A e as outras duas das marcas B e E. Duas amostras da marca E apresentaram reativação da enzima, não confirmando assim o resultado positivo inicial. Para a avaliação da sensibilidade do método rápido de Scharer, manteigas foram fabricadas a partir de creme pasteurizado adicionado de quantidades de 0,000%; 0,010%; 0,015%; 0,025%; 0,050% e 0,100% (v/v) de creme cru. Por meio do método visual foi possível detectar apenas concentrações a partir de 0,050% de creme cru, não apresentando sensibilidade condizente com o método fluorimétrico. O método espectrofotométrico foi mais sensível, sendo capaz de detectar a concentração de creme cru correspondente ao limite estabelecido, mas que não correspondia à concentração de creme cru e à quantidade de fenol/g de amostra preconizadas por alguns autores como indicativos de pasteurização ineficiente (0,1% de contaminação com creme cru e 1,0 µg de fenol/g de amostra, respectivamente). O desenvolvimento da nova metodologia baseou-se na realização de modificações no método rápido de Scharer. Utilizou-se alíquotas de 0,5 mL de fase aquosa para a análise da atividade da ALP, em substituição à alíquota de 0,5 g de manteiga, utilizada no método convencional. A fase aquosa foi obtida a partir da fusão da manteiga a 45 ºC e subseqüente centrifugação a 1200 x g por 10 minutos. Nas amostras avaliadas, foi possível distinguir visualmente as manteigas com atividade igual ou próxima a 350,0 mU/Kg (coloração esverdeada) das manteigas pasteurizadas (coloração amarela) e dos controles negativo e de interferentes. Na análise espectrofotométrica, obteve-se um valor médio para a atividade residual da ALP de 0,115 µg de fenol por amostra (0,5 g de manteiga) de manteiga, pelo método rápido de Scharer convencional e 0,385 µg de fenol por amostra (0,5 mL de fase aquosa), pelo novo método desenvolvido. Estes valores sugerem que a sensibilidade do método convencional foi aumentada em, aproximadamente, 3,3 vezes. O método modificado apresentou limite de detecção da atividade da ALP de acordo com os limites estabelecidos pela FDA, e constitui uma alternativa de custo mais acessível para a determinação de baixas concentrações residuais desta enzima em manteiga.The alkaline phosphatase (ALP) is enzyme naturally present in the milk. It s concentration depends the animal breed, feed, period of lactation, yield, season the year. In this work, mediums values for the activity this enzyme in the padronized raw cream (40,0% to 41,0% of fat) during the summer, the fall and the winter using the fluorimetric was 17.264.214 + 2.554.645, 17.719.500 + 5.476.910 and 14.196.714 + 1.375.055 mU/L, respectively. The analyses of ALP is used in the dairy industry to determine efficient the pasteurization. However, scientific works about this enzyme in cream are scarce, mainly in Brazil, where his analyses isn t an obliged procedure for assessment the quality butter, how happen in another countries. According to Food and Drug Administration (FDA), the maximum residual of ALP in pasteurized milk and dairy products by the fluorimetric method must be below 350 mU/Kg. There have been analyzed residual ALP, the sensitivity and the limit of detection of commercial butter samples, by visual Scharer and spectrophotometric method to compared with fluorimetric method and new method with high sensitivity was developed and its cost is smaller for determination residual ALP butter. Of the 20 samples commercials butter four (20%) presented positive resulted residual ALP, two was brand A and another two is brand B and E. Two samples of brand E presented enzyme s reactivation, didn t have confirm the initial positive resulted. In the assessment of sensitivity method Scharer s rapid visual, butters were obtained by addition in different proportions: 0,000%; 0,010%; 0,015%; 0,025%; 0,050% and 0,100% (v/v) of raw cream. The visual method was able to detect only concentrations by addition 0,050% raw cream, doesn t presented sensitivity in accordance with method fluorimetric. The spectrophotometric method was more sensitive, because detect concentration of raw cream corresponding detection limit, but it doesn t corresponded the concentration of raw cream and magnitude phenol/g of sample recognized by several authors that indicated incorrectly pasteurized using this method (0,1% of contamination with raw cream and 1,0 µg phenol/g by sample, respectively). The development new method consists in modification in the fast method of Scharer. There have been used 0,5 ml of water phase for analyses ALP, in replacement to the aliquot 0,5 g butter, used in the conventional method. The water phase was obtained by butter fusion 45 °C and followed centrifugation 1200 x g for 10 minutes. In the six repetitions, was possible distinguish visually butter with equal activity or near a 350 mU/Kg ( limits butters ) by pasteurized butters and controls negative and interferents. In the analyses spectrophotometric, it got a value medium residual ALP 0, 115 µg phenol for sample (0,5g of butter), using the conventional method Scharer s rapid and 0,385 µg de phenol for sample (0,5 mL water phase), using the new method development. These values suggest sensitivity conventional method was increase approximately 3,3 times. The modified method presented limit detection of ALP in accordance with establishment FDA so it is an alternative with lower costs for detection the lower residuals levels this enzyme in butter.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic