Isolation and characterization of bacteriophages for biocontrol of Pseudomonas spp. in Frescal Minas cheese

O objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar e utilizar bacteriófagos líticos no biocontrole de Pseudomonas spp. em queijos Minas Frescal. Foram isolados e caracterizados bacteriófagos obtidos de água residuária de laticínios e de exsudado de frangos congelados. Após propagação, os bacteriófagos alcançaram contagens entre 10-10 e 10-11 UFP. mL-1 e foram avaliados quanto à especificidade para a distintos gêneros e espécies de estirpes microbianas e em relação às estirpes bacterianas isoladas de queijo Minas Frescal obtidos no comércio varejista de Viçosa e região de diferentes épocas e produtores. Foram caracterizados quanto à morfologia e diversidade genética. Os bacteriófagos apresentaram baixo espectro de ação entre gêneros diferentes de bactérias e amplo espectro entre espécies diferentes do mesmo gênero. Quanto a atividade lítica dos bacteriófagos às estirpes bacterianas isoladas de queijos Minas Frescal do comércio varejista, o bacteriófago isolado de exsudado de frango apresentou especificidade contra um maior número de estirpes em comparação ao bacteriófago isolado de água residuária de laticínios. Os dois bacteriófagos não demonstraram diferenças no perfil genômico, exibiram morfologias semelhantes, apresentando cabeça icosaédrica e caudas curtas, o que indica serem da família Podoviridae e ordem Caudovirales. Através de testes bioquímicos e técnica de PCR foram realizadas a identificação e confirmação das estirpes bacterianas isoladas de queijo Minas Frescal do comércio varejista, demonstrando maioria na identificação pertencente ao gênero Pseudomonas spp. Foram fabricados queijos Minas Frescal em condições laboratoriais afim de verificar a eficiência do uso conjunto dos bacteriófagos nas concentrações 10-4, 10-6 e 10-8 PFU. mL1 no biocontrole de micro-organismos deterioradores. Os parâmetros microbiológicos avaliados incluíram contagens de Pseudomonas spp., microorganismos proteolíticos, bacteriófagos no leite, no soro, nos queijos e no exsudado dos queijos e os físico-químicos foram pH, porcentagem de cloretos e perda de massa durante 21 dias sob refrigeração. Observou-se nesta avaliação o efeito do uso em conjunto de bacteriófagos sobre a contagem de Pseudomonas spp e microorganismos proteolíticos em queijos Minas Frescal mostrando dependência na concentração utilizada. As maiores reduções nas contagens de Pseudomonas spp e micro-organismos proteolíticos foram observadas na concentração 10-4 PFU. mL-1. Já as concentrações de bacteriófagos 10-6 e 10-8 PFU mL-1 não demonstraram efeito no controle da multiplicação destes micro-organismos durante o tempo de estocagem. Resultados semelhantes foram observados quando avaliado a contagem de micro-organismos proteolíticos, ao qual a concentração de bacteriófagos 10-4 PFU mL-1 demonstrou maior eficiência na inibição da multiplicação destes micro-organismos. Foi verificado um decréscimo na contagem de bacteriófagos, porém, a presença destes nos queijos continuaram durante o tempo de estocagem. Não houve variação significativa em relação ao pH, massa dos queijos e percentagem de cloretos durante o período de estocagem. Dessa forma, conclui-se que o uso conjunto de bacteriófagos líticos isolados de diferentes ambientes apresentam potencial de utilização no biocontrole de Pseudomonas spp. em queijos Minas Frescal.The aim of this study was to isolate, characterize and use the lytic bacteriophages in biocontrol Pseudomonas spp. in Minas Frescal cheese. Bacteriophages obtained from dairy wastewater and exudate of frozen chickens were isolated and characterized bacteriophages obtained from dairy wastewater and exudate of frozen chickens. After propagation, bacteriophages achieved counting between 10-10 and 10-11 PFU. mL-1 and were evaluated for specificity to different genera and species of microbial strains and in relation to bacterial strains isolated from Minas Frescal cheese obtained in retail stores in Viçosa region and from different periods and producers. They were then characterized for the morphology and genetic diversity. Bacteriophages presented a low spectrum of action between different genera of bacteria and wide spectrum of different species of the same genus. As to the lytic activity of the bacteriophage to the bacterial strains isolated from cheese Minas Frescal retail, the bacteriophage isolated of exudate chicken showed specificity against a larger number of strains in comparison to the bacteriophage isolated from dairy wastewater. The two bacteriophages showed no differences in genomic profiling, these exhibited similar morphologies, with icosahedral heads and short tails, indicating that they belong to the family Podoviridae and order Caudovirales. Through biochemical tests and PCR were performed and confirmed the identification of bacterial strains isolated from Minas Frescal cheese retail, demonstrating majority in the identification of the genus Pseudomonas spp. Frescal Minas cheeses were manufactured under laboratory conditions in order to verify the efficiency of the combined use of bacteriophages at concentrations 10-4, 10-6 and 10-8 PFU. mL-1 in the biocontrol of deteriorative microorganisms. The microbiological parameters have includedcounts of Pseudomonas spp. Proteolytic micro-organisms, bacteriophages in milk, whey, cheese and the in the exudate of the cheeses and the physicochemical were pH, chlorides and percentage of weight loss during 21 days under refrigeration. It was noted in this review that the effect of the combined use of bacteriophages on the count of Pseudomonas spp and proteolytic micro-organisms in Minas cheese Frescal showing dependence on concentration used. The largest reductions in the counts of Pseudomonas spp and proteolytic micro-organisms were observed in the concentration 10-4 PFU. mL-1. As for the concentrations of 10-6 and 10-8 PFU. mL-1 bacteriophages. showed no effect in controlling the growth of these micro-organisms during storage period. Similar results were observed when measured count proteolytic microorganisms to which the bacteriophage concentration of 10-4 PFU mL- 1 showed a higher efficiency in inhibiting the proliferation of these micro-organisms. It was observed a decrease in the count of bacteriophages, however, the presence of the cheeses continued during the storage time. No significant changes in relation to pH, mass of cheeses and percentage of chlorides during the storage period. Thus, it is concluded that the combined use of lytic bacteriophages isolated from different environments have potential use in the biocontrol of Pseudomonas spp. in Minas Frescal.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerai