Purification and characterization of a β-xylosidase from the phytopathogenic fungus Ceratocystis fimbriata RM 35

Os objetivos deste trabalho foram cultivar o fungo fitopatogênico Ceratocystis fimbriata RM 35 para produção de β-xilosidases, purificar e caracterizar esta enzima, visando sua aplicação em processos industriais de branqueamento de polpa de celulose, produção de biocombustíveis, e na produção de xilitol, utilizado na indústria alimentícia e na área odontológica e médica. Para produção da β-xilosidase extracelular, o fungo foi cultivado por 168 h em meio mineral contendo farelo de trigo como fonte de carbono. Após este período, o meio foi filtrado, centrifugado e utilizado como fonte de enzimas β-xilosidases. A enzima foi purificada por cromatografias de troca iônica, filtração em gel e eletroforese em gel de poliacrilamida, sob condições não desnaturante. Ao final do processo de purificação, a β-xilosidase apresentou um fator de purificação de 18,29 vezes, com um rendimento de 22,5 %. A massa molecular da enzima foi de aproximadamente 161,6 kDa, quando estimada por SDS-PAGE, e de aproximadamente 204,2 kDa, quando estimada por filtração em gel. A enzima apresentou atividade máxima em pH 3,9 e na temperatura de 65 °C, sendo estável na temperatura de 60 °C por 24h. Os valores de KM e Vmax, utilizando o substrato ρ-NP-βXil, foram 0,326 mM e 0,91x10-3 mM/min, respectivamente. A enzima apresentou atividade muito reduzida com o substrato sintético ρ-nitrofenil-β-glicopiranosídeo. A atividade enzimática foi parcialmente inibida por sulfato de cobre II, cloreto de alumínio III, SDS e xilose, todos nas concentrações finais de 1 e 10 mM. C. fimbriata é um fungo fitopatogênico e encontrada causando doenças em diversas culturas de grande valor econômico. Assim, a caracterização bioquímica e cinética de β-xilosidase, e a avaliação dos potenciais para aplicação dessas enzimas, pode ser uma alternativa promissora e econômica para melhorar a qualidade de processos industriais da produção de xilitol, do branqueamento de polpa de celulose e da produção de biocombustíveis, além de um passo importante na elucidação da interação planta-patógeno, no desenvolvimento da doença causada por este fungo.The objectives were to cultivate the plant pathogenic fungus Ceratocystis fimbriata RM 35 for the production of β-xilosidases, purify and characterize this enzyme, for their application in industrial bleaching of cellulose pulp, biofuel production and production of xylitol, used in the food industry and indental and medical. For production of extracellular β-xylosidase, the fungus was grown for 168 h in mineral medium containing wheat bran as carbon source. After this period, the medium was filtered, centrifuged and used as a source of β-xilosidases enzymes. The enzyme was purified by ion exchange chromatography, gel filtration and polyacrylamide gel electrophoresis under nondenaturing conditions. At the end of the purification process, the β-xylosidase showed a purification factor of 18.29 fold with a yield of 22.5 %. The molecular weight of the enzyme was approximately 161.6 kDa, as estimated by SDS-PAGE, and about 204.2 kDa, as estimated by gel filtration. The enzyme showed maximum activity at pH 3.9 and temperature 65 ° C and was stable at 60 ° C for 24h. The KM and Vmax values, using the substrate ρ-NP-βXil were 0.326 mM to 0.91×10-3 mM/min, respectively. The enzyme showed very low activity with the synthetic substrate ρ-nitrophenyl-β-glucopyranoside. The enzymatic activity was partially inhibited by copper II sulfate, aluminum chloride III SDS and xylose, all final concentrations of 1 and 10 mM. C. fimbriata is a plant pathogenic fungus causing disease and found in various cultures of high economic value. Thus, the biochemical and kinetic characterization of β-xylosidase, and assessment of potential for application of these enzymes may be a promising and cost to improve the quality of industrial processes for the production of xylitol of bleaching of cellulose pulp and the production of biofuels, and an important step in the elucidation of plant-pathogen interaction in the development of disease caused by this fungus.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio