Obtainment of hybridomas for production of monoclonal antibodies against the E-NTPDase-2 of Leishmaniasis major protein

As Leishmanioses são doenças parasitárias causadas por protozoários da ordem Kinetoplastida, família Trypanossomatidae e gênero Leishmania que atualmente representam um problema de saúde pública no Brasil e em outros países do mundo. As E-NTPDases ou apirases, presentes nesses parasitos, têm como principal função a degradação de nucleotídeos, especialmente extracelulares di e/ou trifosfatados, permitindo ao parasito a modulação da resposta imune do hospedeiro, que necessecita da sinalização purinérgica, e favorecendo o desenvolvimento celular por sua participação na via de recuperação de purinas das quais os parasitos são dependentes. Os anticorpos monoclonais são oriundos de um hibridoma para reconhecimento de um determinado antígeno e podem ser selecionados para uma especificidade desejada, produzidos em grande quantidade e com boa qualidade. Este trabalho teve como objetivo a expressão heteróloga da proteína E-NTPDase-2 de L.major e produção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais contra esta proteína. Para isso foi feito o desenho de iniciadores específicos visando a amplificação da região codificante da porção solúvel (ecto-domínio) da E-NTPDase-2, sem a porção codificante para a região do peptídeo aminoterminal, perfazendo um DNA com 1053 pares de base. O amplicom foi obtido com amplificação por PCR, clonado em vetor de amplificação (pJET-bunt) e de expressão (pET-21b) em sistema bacteriano (E.coli DH5α). A expressão da proteína E-NTPDase-2 foi realizada em sistema bacteriano (E.coli BL-21) e a purificação foi feita por cromatografia de afinidade em coluna de Ni2+-agarose (Ni-NTA). Com a proteína purificada procedeu-se as imunizações dos camundongos e consequente confirmação da produção de anticorpos anti- NTPDase 2 por DOT ELISA. A fusão da células B dos camundongos imunizados, com as células de mieloma (Sp20) foi realizada para obteção dos hibridomas. Desta maneira foram isolados hibridomas anti-E-NTPDase-2 de L.major que poderão ser utilizados em várias aplicações futuras, como o diagnóstico e tratamento da Leishmaniose canina.Leishmaniasis are parasitic diseases caused by protozoa of the Kinetoplastida order, Trypanossomatidae family and Leishmania genus. It currently represents a public health problem in Brazil and other countries in the world. The E-NTPDase or apyrases present in such parasites are mainly responsible for the degradation of nucleotides, especially extracellular di- and/or triphosphate, thus allowing the parasite to modulate an immune response in the host, which needs a purinergic signalling, and promoting the cellular development for its participation in the purine salvage pathway, in which the parasites are dependent. Monoclonal antibodies are originated of a hybridoma for the recognition of a specific antigen and can be selected for a desired specificity as well as produced in large scale and with good quality. This research aimed the expression of the heterologous L.major E-NTPDase-2 proteins and the production of monoclonal antibody-secreting hybridomas against such protein. A design of specific primers aiming the amplification of the coding region of the soluble portion (ecto-domain) of the E-NTPDase-2 was proposed, without the coding region for the amino-terminal peptide portion, resulting in a 1053-base-pair DNA. The amplicon was obtained by PCR amplification, cloned into an amplification (pJET-bunt) and expression (pET-21b) vector of bacterial system (E. coli DH5α). The protein expression of the ENTPDase- 2 was carried out in a bacterial system (E. coli BL-21) and the purification was performed by affinity chromatography on a Ni2+-agarose column (Ni-NTA). With the purified protein, immunizations of the mice were conducted with subsequent confirmation of the production of anti-NTPDase-2 antibodies, by means of DOT ELISA. The fusion of the B cells from the immunized mice, with the myeloma cells (Sp20), was performed in order to obtain the hybridoma. Then, hybridoma of L.major anti-E-NTPDase-2 were isolated making its usage possible in several future applications such as the diagnosis and treatment of canine leishmaniasis.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic