Molecular analyses of cell death pathways signalling originated in the endoplasmic reticulum

Estresses bióticos e abióticos são responsáveis por grandes perdas da produção vegetal em todo o mundo. Consequentemente, a elucidação dos mecanismos pelos quais estes organismos respondem e se adaptam a tais condições tem se tornado fundamental para o desenvolvimento de plantas melhor adaptadas. Recentemente, foi identificada uma via de sinalização inédita, mediada por proteínas ricas em asparagina (NRPs), que transduz sinais de morte celular originados por estresses no retículo endoplasmático (RE) e estresse osmótico. Esta via de resposta a estresses foi designada via integrativa por integrar sinais de estresses no RE e osmótico em uma resposta adaptativa comum e potencializada. Os objetivos da presente investigação foram (i) identificar componentes da via integrativa e (ii) analisar a função de BiP, um regulador de vias de resposta a estresses no RE, como atenuador de morte celular programada em plantas e sua possível conexão com a via integrativa. Inicialmente, foi construída uma biblioteca de cDNA duplo-híbrido de soja, preparado de folhas estressadas por tunicamicina, um indutor de estresse no RE, e PEG (estresse osmótico). Por meio de varredura de bibliotecas duplohíbrido de cDNA, foi identificada uma proteína de soja, pertencente à famíliaUSP (universal stress protein) e aqui designada GmUspA, pela sua capacidade de interagir com NRP-B. Interação de GmUspA com NRP-B é mediada pela região carboxi-terminal da proteína, enquanto que a proteína GmUspA completa perde a habilidade de interagir com NRP-B no sistema duplo híbrido de leveduras, sugerindo que a formação do complexo in vivo pode ser dependente de mudança de conformação induzida por ligantes. O gene GmuspA exibe um padrão de expressão similar aos genes NRP-A e NRP-B, sendo regulados positivamente por estresses do RE e osmótico, embora com cinética de indução diferenciada. Além disso, foi demonstrado por microscopia confocal que a proteína GmUspA fusionada a GFP localiza-se no citoplasma, possibilitando interações com a proteína NRP-B associada a membranas, o que foi demonstrado por "immunoblottings" de fracões microssomais. Coletivamente, estes resultados indicam que a interação entre NRP-B e GmUspA pode potencialmente ocorrer in vivo e ser biologicamente relevante. Para avaliar a função de BiP como modulador de morte celular programada (PCD) em plantas, os níveis de BiP foram manipulados em plantas transgênicas desafiadas com indutores químicos de morte celular. Foi demonstrado que a superexpressão de BiP atenuou morte celular induzida por estresse no RE, estresse osmótico e por cicloheximida. Expressão ectópica de BiP em plântulas transgênicas de soja reduziu as lesões necróticas de folhas cotiledonárias causadas pelos indutores de morte celular, tunicamicina e cicloheximida, e manteve o turgor foliar sob condições de desidratação induzida por PEG. A atenuação de morte celular mediada por BiP foi confirmada pela falta de indução e, em alguns casos, pelo atraso na expressão de genes associados à senescência em plântulas transgênicas super expressando BiP. Este fenótipo de morte celular atenuada foi coordenado com decréscimo ou atraso na indução dos marcadores de morte celular NRP-A e NRP-B que estão envolvidos em transduzir um sinal de PCD emanado do estresse no RE e estresse osmótico. Um direto envolvimento de BiP na modulação da resposta de sinalização de morte celular mediada por NRPs foi examinado por meio de um ensaio de expressão transiente por agroinoculação em folhas de tabaco de linhagens transgênicas com expressão aumentada (linhagem senso) ou reduzida (linhagem antiseno) de BiP. Super expressão de BiP preveniu clorose induzida por expressão de NRPs em setores foliares agroinoculados, enquanto que silenciamento de BiP endógeno em linhagens antisenso acelerou o processo de senescência. Estes fenótipos de morte celular foram confirmados pelo teor de clorofila e pelo padrão de indução de genes associados à senescência em linhagens senso e antisenso. Coletivamente, estes resultados indicam uma correlação direta entre os níveis de BiP e senescência induzida por NRPs e apontam favoravelmente para um envolvimento direto de BiP como modulador da resposta de morte celular programada mediada por NRPs.Abiotic and biotic stresses are responsible for major losses in agricultural productivity world wise. Therefore, the understanding of mechanisms of plant stress response and adaptation to such conditions should provide the foundation for engineering plant stress tolerance and hence maximizing the yield of crops growing under adverse environmental conditions. Recently, we identified a novel signaling pathway, mediated by the asparagine -rich proteins (NRPs), that transduces cell death signals emanated from ER and osmotic stresses. This novel signaling response was designated integrative pathway since it integrates the ER- and osmotic-stress signals into a common adaptive response. The goals of the present investigation were two-fold: (i) to identify components of the integrative pathway and (ii) to analyze the BiP function, a regulator of ER-stress response pathways, as a modulator of cell death in plants and its possible connection with the integrative pathway. Initially, we constructed a two-hibrid cDNA library of soybean mRNAs prepared from leaves stressed with tunicamycin, a potent inducer of ER-stress, and PEG that mimics osmotic stress. By screening the cDNA library with NRP-B as bait, we identified a soybean protein that belongs to the UspA (universal stress protein) family that was designated here as GmUspA. GmUspA-NRP-B interaction was mediated by the carboxyl-terminal of the protein and full-length GmUspA failed to Interact with NRP-B by the two-hybrid system in yeast. This result suggests that complex formation in vivo may be dependent on induced-conformational changes mediated by bound proteins. Like NRP-A and NRP-B, GmuspA was up-regulated by ER- and osmotic-stress although with a different induction kinetics.Furthermore, we demonstrated by confocal microscopy that GmUspA fused toGFP is located to the cytoplasm favoring the possibility of interactions with membrane-associated proteins, like NRP-B. Thepreviously identified membrane localization of NRP-B was further confirmed here by immunoblottings of microssomal fractions. Taken together, these results indicate that NRP-B -GmUspA interaction may occur in vivo and may be biologically relevant. In order to evaluate the role of BiP as modulator of programmed cell death (PCD) in plants, the BiP levels were manipulated in transgenic lines challenged with chemical inducers of cell death. We demonstrated that BiP overexpression attenuated cell death caused by ER stress, osmotic stress and cycloheximide induced stress. Ectopic expression of BiP in soybean transgenic lines reduced cotyledon leaf necrotic lesions promoted by the cell death inducers tunicamycin and cycloheximide, and maintained shoot turgidity under PEG-induced dehydration. The BiP-mediated attenuation of cell death was confirmed by the lack of induction and in some cases by delayed expression of senescenceassociated genes in BiP-overexpressing transgenic lines. This phenotype of attenuated cell death was coordinated with a decrease or delay in the induction of the cell-death genes NRP-A and NRP-B, which are involved in transducing a PCD signal emanated from ER stress and osmotic stress. The possible involvement of BiP in modulating NRPs-mediated cell death responses was directly examined through transient expression assays mediated by agroinoculation in tobacco leaves with enhanced (sense lines) or suppressed (antisense lines) expression of BiP. BiP overexprssion in sense lines prevented NRPs-induced chlorosis in agroinoculated leaf sectors, whereas silencing of BiP in antisense lines accelerated the onset of leaf senescence. These cell death phenotypes were confirmed by measuring chlorophyll loss and expression of senescence-associated genes in sense and antisense lines. Collectively, these results indicate a direct co-relation between the levels of BiP and NRPs-induced senescence and argue favorably for an involvement of BiP in modulating the NRPs-mediated PCD response.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic