Substâncias inibidoras produzidas por culturas de Lactococcus lactis isoladas de salame fermentado naturalmente

Neste trabalho, as bacteriocinas produzidas por culturas de Lactococcus lactis isoladas de salame fermentado naturalmente no Brasil foram purificadas e identificadas. O sequenciamento dos produtos amplificados por PCR comfirmou que os genes estruturais das bacteriocinas em todas as culturas de L. lactis são idênticos ao do lantibiótico nisin Z. Plasmídeos foram detectados em todas as culturas de L. lactis e foi observado que culturas curadas foram capazes de produzir bacteriocinas, indicando que os genes relacionados à produção da bacteriocina estão localizados no cromossomo. As bacteriocinas foram purificadas utilizando precipitação das proteínas com sulfato de amônio, cromatografias de troca iônica e de fase reversa, e suas massas moleculares foram confirmadas por MALDI-TOF-TOF. A produção da bacteriocina foi investigada sob diferentes condições de crescimento. Em todas as culturas, a produção de bacteriocina foi paralela ao crescimento celular e alcançou atividade máxima na fase estacionária. Todas as culturas apresentaram produção máxima de bacteriocinas em valores de pH 6.0 e 6.5, em condições de aerobiose e em temperaturas de 25 °C e 30 °C, em meio LAPTg. Triptona e peptona de caseína foram as melhores fontes de nitrogênio para produção das bacteriocinas em todas as culturas. A fonte de carbono foi um dos principais fatores que influenciou a produção de nisin Z. Sacarose foi a fonte de carbono mais eficiente na produção de bacteriocinas pelas culturas de L. lactis ID1.5, ID8.5, PR3.1 e PD4.7, enquanto a frutose foi a fonte de carbono mais eficiente para L. lactis ID3.1. As culturas apresentaram valores de atividades de bacteriocina diferentes, sendo as máximas atividades observadas nas culturas de L. lactis ID1.5 e ID8.5. As sequências dos promotores nisZ e nisF obtidas de todas as culturas foram idênticas entre si, contudo outros fatores podem estar envolvidos nas diferenças da produção das bacteriocinas entre as culturas. Além disso, dois compostos antimicrobianos, de baixo peso molecular, produzidos por L. lactis ID1.5, denominados neste estudo AI e AII, foram purificados e parcialmente caracterizados. O composto AI apresentou um espectro antimicrobiano principalmente contra culturas de L. lactis, incluindo a própria cultura produtora. L. lactis LMGT 2122, Bacillus subtilis DSMZ 347, Listeria innocua BL86/26B, Streptococcus pneumoniae TIGR 4 e Pseudomonas aeruginosa foram os micro-organismos mais sensíveis ao composto AII. A atividade antimicrobiana de ambos compostos foi drasticamente reduzida após tratamento com tween 80, mas a atividade foi mantida após o tratamento térmico e com proteases. Os compostos AI e AII apresentaram propriedades distintas de outras substâncias antimicrobianas produzidas por L. lactis e relevante efeito inibitório contra patógenos do sistema respiratório.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoIn this study, bacteriocins produced by Lactococcus lactis strains isolated from naturally fermented sausage in Brazil were purified and identified. PCR product sequencing confirmed that the structural bacteriocin genes of the all strains are identical to lantibiotic nisin Z. Plasmids were detected in all strains of L. lactis, and it was observed that cured derivatives from all strains were able to produce bacteriocins, indicating that the genes encoding the bacteriocin are located on the chromosome. Bacteriocins were purified to homogeneity from culture supernatants by ionic exchange and reversed-phase chromatography and their molecular masses were confirmed by MALDI-TOF/TOF. The production of the bacteriocin was investigated under different growth conditions. For all of the strains, bacteriocin production appeared to parallel cell growth and reached its maximal activity at the stationary phase. All strains produced bacteriocin efficiently at initial pH values of 6.0 and 6.5, under aerobic conditions and at 25 °C and 30 °C in LAPTg medium. Tryptone and casein peptone were found to be the optimal organic nitrogen source for the bacteriocin production for all strains. Carbon source appears to be a major control mechanism for nisin Z production. Sucrose was the most efficient carbon source for bacteriocin production of L. lactis ID1.5, ID8.5, PR3.1 and PD4.7, while fructose was the most efficient carbon source for strain L. lactis ID3.1. The strains presented different activity values of bacteriocins, maximal activity was recorded by L. lactis ID1.5 and ID8.5. The nisZ and nisF promoter sequences obtained from all strains are identical, suggesting that there should be other factors involved in difference of production of bacteriocins among those strains. In addition, two cellbound antimicrobial compounds, of low molecular weight, produced by L. lactis ID1.5 were purified and partially characterized. After purification by cationic exchange, solid phase C18 column and three runs of reversed-phase chromatography, antimicrobial activity was recovered with 60% and 100% 2-propanol, suggesting that more than one antimicrobial compound, called in this study AI and AII, were produced by L. lactis ID1.5. Compond AI has a spectrum of antimicrobial activity mainly against L. lactis, including its producer strain. L. lactis LMGT 2122, Bacillus subtilis DSMZ 347, Listeria innocua BL86/26B, Streptococcus pneumoniae TIGR 4 and Pseudomonas aeruginosa seem to be the organisms most sensitive to compound AII. The antimicrobial activity of both compounds was drastically reduced by treatment with tween 80, but it was present after heat and proteases treatments. These compounds show distinct properties from other antimicrobial substances produced by L. lactis, and have a significant inhibitory effect against clinically important respiratory pathogens