Effects of Thiodan® in liver and ovaries in advanced maturation of the lambari Astyanax bimaculatus

O agrotóxico Thiodan® (350g/L de endosulfan) é um inseticida organoclorado utilizado em diversas monoculturas que pode chegar aos ecossistemas aquáticos e afetar a reprodução e a integridade das populações de peixes. O fígado é um dos principais órgãos para a biotransformação de diversos xenobióticos. Quando os peixes são expostos a uma concentração elevada de agentes químicos podem ocorrer danos hepáticos. Os ovários de peixes apresentam folículos em diferentes estádios de desenvolvimento que são envoltos por zona radiata, células foliculares, membrana basal e células da teca, formando o complexo folicular. Agentes estressores podem causar aumento ou diminuição do diâmetro dos folículos vitelogênicos, alterar a quantidade de folículos nos diferentes estádios de desenvolvimento e aumentar a incidência de atresia. Assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do Thiodan® sobre o fígado e ovários de lambaris Astyanax bimaculatus por meio de análises morfológica, morfométrica e imunoistoquímica. Os peixes expostos ao tóxico foram divididos em quatro experimentos: 1) sem aclimatação e sem alimentação; 2) sem aclimatação e alimentados; 3) com aclimatação de 10 dias e sem alimentação; 4) com aclimatação de 10 dias e alimentados. Em todos os experimentos foram utilizadas três concentrações diferentes do Thiodan® inferiores à CL50 de 13,67&#956;g/L pré-determinada em laboratório de acordo com a NBR 15088 (ABNT, 2007). As concentrações utilizadas em cada experimento foram de 1,15; 2,3 e 5,6&#956;g/L, além de um grupo controle livre de tóxico, com três repetições contento 10 peixes para cada concentração. Após as 96h, seis peixes de cada grupo foram capturados e anestesiados com benzocaína (1:10.000), de acordo com as Normas da Comissão de Ética do Departamento de Veterinária/UFV (protocolo 24/2009). Os fígados e ovários foram coletados e processados por técnicas histológicas rotineiras. As lâminas foram analisadas em microscópio de luz Olympus CX31. Foram obtidas imagens digitais de 10 campos aleatórios por animal em objetiva de 20X e 40X para avaliação histológica. As características da água utilizada nos testes em sistema estático foram mantidas de acordo com as recomendações da NBR 15088 (ABNT, 2007). A análise histológica dos fígados mostrou, no experimento 1 (sem aclimatação/sem alimentação), na concentração de 5,6&#956;g/L de Thiodan®, a menor intensidade (0,10±0,0) da reação ao PAS no citoplasma dos hepatócitos quando comparada ao grupo controle (1,33±0,51). No entanto, houve diferença (P<0,05) nesse mesmo experimento quando comparado com as concentrações 1,15&#956;g/L (2,66±0,81) e 2,3&#956;g/L (3,00±0,0) caracterizando depleção de glicogênio. Além disso, houve alterações do diâmetro de núcleos e citoplasma dos hepatócitos nos diferentes experimentos, e maior quantidade de núcleos de hepatócitos nos grupos expostos ao Thiodan® associada com a redução na quantidade de citoplasma. O Índice de Alteração Histológica (IAH) dos lambaris coletados manteve-se entre 4,33 a 8,33 (para os grupos controles); 18,50 a 28,83 (para as concentrações de 1,15&#956;g/L); 20,33 a 28,33 (para as concentrações de 2,3&#956;g/L) e 23,66 a 27,66 (para as concentrações de 5,6&#956;g/L). Os lambaris coletados nos diferentes experimentos apresentaram valores de IAH para os grupos controle inferiores (P<0,05) aos grupos expostos. Estes resultados demonstraram que o Thiodan® pode estar influenciando as funções hepáticas pela maior mobilização das reservas de glicogênio na concentração 5,6&#956;g/L. As alterações observadas nos fígados dos lambaris não foram severas, sendo alterações de estádio I e II, indicando dano reparável do tecido hepático nos diferentes grupos e experimentos. Nos ovários, percebeu-se que a ação do Thiodan® em níveis subletais não afetou a morfologia dos diferentes estádios de desenvolvimento folicular. Porém, os experimentos com aclimatação demonstraram alterações nas quantidades de folículos primários e secundários quando comparados com os peixes dos experimentos sem aclimatação. Além disso, houve aumento do número de folículos atrésicos e diâmetro dos folículos secundários nos grupos expostos ao Thiodan® nos diferentes experimentos. Estes resultados sugerem mecanismos compensatórios da perda reprodutiva quando em meio com condições desfavoráveis. As análises imunoistoquímicas demonstraram marcação crescente e uniforme ao longo do desenvolvimento folicular para integrina &#946;1 e colágeno tipo IV. Entretanto, a caspase 3 foi observada somente no complexo folicular de folículos secundários, mesmo quando os peixes são expostos a diferentes concentrações de Thiodan®, o que confirma a integridade das células foliculares e da via apoptótica caspase-3-dependente, a qual pode estar sendo ativada para futuros processos de regressão folicular.The pesticide Thiodan® (350g.L-1 of endosulfan) is an organochlorine insecticide used in various monocultures that may reach aquatic ecosystems and affect reproduction and the health of fish populations. The liver is a major organ for the biotransformation of many xenobiotics, and it can be damaged if the fish are exposed to a high level of chemical substances. The fish ovaries have oocytes at different stages of development that are surrounded by zona radiata, follicular basal membrane and teca cells to form the follicular complex. Stressor products may cause an increase or decrease in the diameter of the secondary follicles, vitellogenic depletion, a change the number of follicles at different stages of development and an increase the incidence of atresia. The present study aimed to evaluate the effects of Thiodan® on the liver and ovaries of Astyanax bimaculatus through morphological, morphometric and immunohistochemistry analysis. The groups of fish were exposed to the toxic substances divided in four experiments: without adaptation and no feeding, feeding without adaptation, with adaptation and no feeding, with adaptation and feeding. All experiments used three different concentrations of Thiodan® lower than the LC50 of 13.67 &#956;g.L-1 previously determined in the laboratory in accordance with the Brazilian Standard Regulation - NBR 15088 (ABNT, 2007). The concentrations used in each experiment were 1.15, 2.3 and 5.6 &#956;g.L-1, and a control group with three repetitions using ten fish in each aquarium. After 96h, six fish from each group were captured and anesthetized with benzocaine (1:10000) according to the norms of the Ethics Committee of the Veterinary Department/UFV (protocol 24/2009). Livers and ovaries were collected and processed by histological techniques. The slides were examined under the light microscope Olympus CX31. Were obtained digital images of 10 random fields per animal at 20X and 40X objective for evaluation. The characteristics of the water used in acute tests were maintained in a stable system in accordance to the recommendations of NBR 15088 (ABNT, 2007). In the experiment 1 (without adaptation/no feeding) at the concentration of 5.6 mg.L-1 of Thiodan® (0.10 ± 0.0), the intensity of the PAS reaction was lower in the cytoplasm of hepatocytes when compared to the control group (1.33 ± 0.51). In the same experiment, differences in glycogen depletion were (P<0.05) when compared to the concentrations 1.15 g.L-1 (2.66 ± 0.81) and 2.3 g.L-1 (3.00 ± 0.0). In addition, changes in the diameter of nuclei and cytoplasm of hepatocytes in all experiments were observed, and an increase in the number of hepatocyte nuclei in groups exposed to Thiodan® was associated with a reduction in the amount of cytoplasm. However, the IHA was maintained between 4.33 to 8.33 (control group); 18.50 to 28.83 (1.15 mg.L-1 group); 20.33 to 28.33 (2.3 g.L-1 group) and 23.66 to 27.66 (5.6 g.L-1 group). These results suggest that Thiodan® may be influencing liver functions to increase glycogen mobilization according to higher concentrations of exposition. The changes observed in the livers of A. bimaculatus were not severe, classified as stage I and II that indicate repairable damage to liver tissue in all experiments. It was observed in the ovaries that the action of Thiodan® in sublethal levels did not affect (P