Purification and characterization of trypsin-like digestive proteases from the velvetbean caterpillar, involved on plant-insect interactions

A Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), conhecida como lagarta da soja, é considerada a principal praga desta cultura, causando enormes prejuízos devido ao ataque herbívoro. Os danos causados pelo ataque da lagarta associados à relevância econômica do cultivo da soja para o Brasil, fomentam a busca por alternativas no controle deste inseto. Devido à importância das proteases digestivas na fisiologia das larvas, o estudo de inibidores de proteases como agentes de controle de pragas tem recebido atenção contínua. A redução da atividade proteolítica através da ingestão de inibidores de proteases, seja por incorporação na dieta ou uso de plantas geneticamente modificadas, compromete a digestão e reflete em efeitos não apenas no crescimento e desenvolvimento das larvas, mas também na fertilidade e fecundidade do adulto. Entretanto, alguns insetos são capazes de desenvolver mecanismos de resistência à presença dos inibidores, envolvendo as próprias proteases digestivas. Torna-se evidente que uma análise caso a caso, partindo do conhecimento do processo digestivo básico do inseto alvo e das enzimas que compõem seu repertório digestivo são fundamentais para que as estratégias de controle que atuam via intestino sejam bem sucedidas pois, desta forma, a seleção ou desenho de inibidores mais específicos e eficientes pode ser alcançada. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a purificação e a caracterização de enzimas digestivas tripsina-like de Anticarsia gemmatalis. Extratos enzimáticos solúvel e não solúvel foram obtidos a partir do intestino de larvas do 5° instar de Anticarsia gemmatalis, mantidas em dieta artificial. Após concentração por ultrafiltração ambos os extratos foram submetidos à cromatografia de afinidade em coluna de p-aminobenzamidina agarose e posteriormente à cromatografia de troca aniônica, obtendo-se as enzimas após a eluição com gradiente salino (NaCl 0 a 1 mol.L-1).O rendimento da enzima presente no extrato solúvel (enzima tripsina-like solúvel) foi de 52% e a atividade específica final de 26,75 μmol.L-1.min-1/mg. A enzima presente na fração não solúvel (enzima tripsina-like ligada à membrana) foi solubilizada com uso detergente (CHAPS) e após as etapas de purificação apresentou um rendimento de 11% e atividade específica de 18,61 μmol.L-1.min-1/mg proteína. A massa molecular determinada para a enzima solúvel e para a enzima ligada à membrana foi 24,9 kDa(SDS-PAGE) e 28.632 Da (MALDI-TOF), respectivamente. Ambas as enzimas apresentaram atividade proteolítica em gel de substrato contendo caseína. Devido ao baixo rendimento e atividade específica, a caracterização cinética da enzima ligada à membrana não foi realizada. A atividade máxima da enzima tripsina-like solúvel foi detectada em pH 9,0 e a 35°C utilizando-se L-BApNA como substrato e em pH 8,0 e a 25°C utilizando-se L-TAME. Os valores de KM obtidos para os substratos L-BApNA e L-TAME foram de 0,12 mmol.L-1 e 49 μmol.L-1, respectivamente. A enzima solúvel foi inibida por PMSF, TLCK e benzamidina, mas não pelo TPCK, confirmando sua classificação como enzima tripsina-like. A atividade enzimática da enzima solúvel não foi afetada pela presença de íons cálcio (0 a 20 mmol.L-1). Os inibidores proteicos da soja, SBTI e SBBI reduziram a atividade em até 80% na maior concentração testada, 0,1 μmol.L-1 e 0,5 μmol.L-1 , respectivamente, tornando-os candidatos aos ensaios de inibição in vivo. A identidade da enzima solúvel não pôde ser estabelecida através da busca por homologia dos peptídeos trípticos em banco de dados pelo MASCOT, embora o maior score obtido tenha sido com uma enzima tripsinalike de outro inseto da mesma ordem (Lepidoptera). A semelhança nos perfis eletroforético e cromatográfico das enzimas solúvel e ligada à membrana suscita a possibilidade da forma ligada à membrana ser precursora da forma solúvel como já foi descrito em outros insetos. Através do conhecimento produzido neste trabalho surgem perspectivas para a realização de pesquisas complementares que poderão contribuir para o desenvolvimento de estratégias de controle de pragas baseadas na inibição de proteases digestivas.Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), the velvetbean caterpillar, is considered the main pest of soybean culture, causing important yield losses due to herbivorous attack. Taking into account the damage caused by the caterpillar and the economic relevance of soybean culture to Brazil, the search for alternative control methods is encouraged. As the digestive proteases play fundamental roles in the larvae physiology, the study of protease inhibitors as agents for pest control is receiving continuous attention. The decrease in proteolytic activity due to the ingestion of proteases inhibitors, by means of the incorporation in the diet or by the use of transgenic plants, impairs the digestion with consequences not only to the larvae growth and development but also to the adult fertility and fecundity. However, some insects develop resistance mechanisms to inhibitors involving their own digestive proteases. It turns out that the success of the strategies for insect control, acting through the gut, depends on a case by case analysis, considering the basic digestive process of the target insect and the enzymes that compose its proteolytic repertoire. Therefore, the selection or design of more specific and efficient inhibitors can be achieved. In this context, this work aimed to purify and characterize trypisin-like digestive proteases from Anticarsia gemmatalis. Soluble and non-soluble extracts were obtained from the gut of Anticarsia gemmatalis fifth instar larvae, reared in artificial diet. After being concentrated by ultrafiltration, the extracts were submitted to an affinity chromatrography on a p-aminobenzamidine column followed by an anionic chromatography. The enzymes were obtained after elution with a saline gradient (NaCl 0 to 1 mol.L-1). The yield of the soluble trypsin-like enzyme was 52% with a final specific activity of 26.75 μmol.L-1.min-1/mg protein. The enzyme present on the non-soluble fraction (membrane bound trypsin-like enzyme) was solubilized with detergent (CHAPS). After the purification steps the yield of this enzyme was 11%, with a final specific activity of 18.61 μmol.L-1.min-1/mg. The molecular mass determined for the soluble enzyme and for the membrane-bound enzyme were 24.9 kDa (SDS-PAGE) and 28.63 Da (MALDI-TOF), respectively. Both enzymes showed proteolytic activity in substrate gel containing casein. Due to the low yield and specific activity of the membrane bound trypsin-like enzyme, no further kinetic characterization was attempted. The maximum activity of the soluble trypsin-like enzyme was detected at pH 9.0 and 35°C with L-BApNA as substrate and at pH 8.0 and 25°C with L-TAME. The KM values obtained for LBApNA and L-TAME were 120 μmol.L-1 and 49 μmol.L-1, respectively. The soluble trypsin-like enzyme activity was inhibited by PMSF, TLCK and benzamidine, but not by TPCK, reinforcing its trypsin-like character. Additionaly, the activity of this enzyme was not affected by calcium ions (0 to 20 mmol.L-1). The soybean proteinaceous inhibitors SBTI and SBBI, at their highest concentration tested, 0.1 μmol.L-1 and 0.5 μmol.L-1, respectively, decreased the soluble trypsin-like enzyme activity at almost 80%, becoming candidates for in vivo inhibition assays. The soluble trypsin-like enzyme identity could not be established by the MASCOT search for homology using the tryptic peptides. However, the highest score was obtained for a trypsin-like enzyme from another Lepidoptera insect. The similarity of eletrophoretic and chromatographic profiles from soluble and membrane bound tripsin-like enzymes supports the hypothesis that the membrane bound enzyme can a precursor of the soluble enzyme, as described for other insects. The knowledge gained by this work brings perspectives for complementary studies which can further contribute to the development of strategies for pest control based on digestive proteases inhibition.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerai