Leaf development in Passiflora edulis Sims.: characterization of the metabolic profiling, gene expression and the role of sugars in modulating the miR156 and miR172 via

No decurso do desenvolvimento pós-embrionário, em algumas espécies vegetais a transição da fase juvenil para a adulta é marcada por alterações na morfologia e anatomia das folhas (heteroblastia) e pela aquisição de competência reprodutiva. Recentemente, considerável progresso tem sido obtido na caracterização dos mecanismos genéticos e moleculares envolvidos nesses processos. Tais avanços demonstram que microRNAs, com destaque para o miR156 bem como seu gene-alvo (SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE PROTEIN-9, SPL9), e miR172 modulam as alterações na morfologia da folha e controlam a transição da fase vegetativa juvenil para adulta em plantas. Estudos prévios têm demostrado que o miR156 é altamente expresso no início do desenvolvimento vegetativo de Arabidopsis thaliana e seus níveis de expressão diminuem com a idade enquanto o miR172 e os fatores de transcrição SPLs envolvidos na expressão de características adultas apresentam um padrão oposto, aumentando à medida que as folhas passam da fase juvenil para a adulta. Contudo, como os níveis do miR156 são regulados ao longo do desenvolvimento vegetativo ainda não foi completamente esclarecido, embora existam evidências de que açúcares sejam os sinais que desencadeiam a transição vegetativa juvenil para a adulta, mediante a regulação dos níveis de miR156. Portanto, visto a importância dos miRNAs no metabolismo vegetal e enfatizando seu papel no controle de transição de fase vegetativa foliar juvenil para adulta, adotou-se como espécie-alvo Passiflora edulis Sims, que possui padrões morfológicos marcantes de transição de fase juvenil-adulto das folhas. Em P. edulis os estágios de desenvolvimento juvenil-adulto são bem caracterizados, de modo que as folhas jovens são monolobadas com lâmina foliar pequena e margem lisa, enquanto as adultas são trilobadas com lâmina foliar maior e margem serrilhada. Ademais, as mudanças na forma e no tamanho da folha juvenil versus adulta ocorrem de maneira gradativa ao longo do desenvolvimento vegetativo, sendo um modelo interessante para estudo do programa genético que controla o processo de heteroblastia. Assim, investigou- se o envolvimento da via regulatória miR156/SPL e miR172 e o papel dos açúcares na modulação dos processos heteroblásticos ao longo do desenvolvimento vegetativo de P. edulis. Os resultados demostraram que, ao longo do desenvolvimento vegetativo de P. edulis, os níveis de expressão do miR156 tenderam ao declínio gradativo com o aumento da maturidade das folha, enquanto o miR172 apresentou padrão oposto. Os níveis de expressão do miR172 aumentaram significativamente a partir da décima folha, a qual reflete a transição de fase vegetativa da espécie. Ainda, as análises de determinação de metabólitos primários mostram correlação positiva entre o aumento dos conteúdos de açúcares e os níveis de miR172 com as alterações na morfologia da folha durante a transição de fase juvenil para a adulta. Adicionalmente, as investigações in vitro evidenciaram que a incorporação de fontes de açúcares ao meio de cultivo de explantes cotiledonares, em especial a glicose, induzem traços heteroblásticos durante a neoformação de estruturas caulinares na organogênese in vitro em P. edulis, mediante a modulação da via miR156/SPL. Tais resultados são corroborados pelos padrões de expressão gênica obtidos, sendo demonstrado uma robusta ligação entre a expressão de miR156 e miR172 com o processo heteroblástico in vitro. De forma que houve acúmulo significativo do miR156 nos tratamentos com maior emissão de brotos e folhas juvenis, enquanto que miR172 apresentou um padrão oposto, com níveis mais expressivos nos tratamentos onde o padrão morfogênico das folhas foi alterado. Ademais, a hibridização in situ mostrou uma distribuição espacial de transcritos de PeSPL9 no meristema apical caulinar e nos primórdios foliares em expansão, sugerindo o envolvimento de SPL9 na morfogênese foliar durante o desenvolvimento vegetativo de P. edulis. Portanto, os resultados aqui apresentados ampliam as bases do conhecimento acerca do papel do metabolismo do carbono, principalmente da glicose, na modulação da via de miR156 e miR172 durante a foligênese em P. edulis, e abre novas perspectivas da participação de açúcares na modulação da via dos microRNA, a serem investigadas em trabalhos futuros.The transition of juvenile-to-adult phase in some plant species is highlighted by changes on leaf morphological and anatomical aspects (heteroblasty) resuming the gain of the reproductive competency acquisition. Recently, the ever growing characterization of genetic and molecular mechanisms has shed light towards unraveling that process. Such approaches demonstrated that microRNAs, in especial miR156 as well as its target gene of SPL (SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE PROTEIN-9, SPL9), and miR172 regulate the changes on leaf morphology and control the transition of juvenile-to-adult vegetative phase. Previous studies demonstrated that miR156 is highly expressed in the initial stages of vegetative development in A. thaliana. Conversely, miR172 and SPL transcription factors related to adult characteristics increase their expression pattern levels in older leaves. However, how miR156 levels are regulated along vegetative development are yet fully clarified, although compelling evidences suggest that sugars are able to trigger the signaling pathway, leading to juvenile-to-adult phase transition by modulating the miR156 transcript levels. The importance of microRNAs into plant metabolism, as highlighted above, enphazises its role on the vegetative juvenile-to-adult phase. Therefore, we used Passiflora edulis Sims as a suitable species to investigate the involvement of regulatory miR156/SPL and miR172 via as well as on the role of sugars in modulating heteroblastic process along vegetative development of this species. Our results showed that throughout vegetative development of P. edulis, the transcripts levels of miR156 presented a slight reduction associated with leaf maturity, whereas miR172 showed opposite pattern. The miR172 expression level increased significantly from the tenth leaf which corresponds with vegetative phase transition of this species. Furthermore, the measurement of primary metabolites had a straightforward correlation between increasing of the sugar content and miR172 transcript levels with changes on the leaf morphology during transition of juvenile-to-adult phase. Additionally, the supplementation of the culture medium with different sugars, in special glucose, induced heteroblastic traits during in vitro shoot neoformation reponses in cotyledonary explants of P. edulis, as mediated by the miR156/SPL via. These results are corroborated by the existing balance between miR156 and miR172 related to their gene expression patterns, which revealed a robust interconnection of both genes with heteroblastic process in vitro. Notably, there was a significant increase of the miR156 in treatments with higher number of shoot-buds and juvenile leaves. However, miR172 presented an opposite behavior with higher transcript levels in the treatments with morphogenetic patterns associated to adult leaf traces. Apart from in situ hybridization showed a spatial distribution of the PeSPL9 in shoot apex and leaf primordia suggesting a role of SPL9 in leaf morphogenesis during vegetative development of P. edulis. Together, the results provide further knowledge on the role of carbon metabolism, mainly played by glucose, on the modulation of the miR156 and miR172 via along leaf neoformation of P. edulis, and open new insights of the role of sugars in modulating microRNA which require further investigation in the future works.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio