Nanovaccines as tumor microenviroment modulators

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019A incidência e a mortalidade associadas ao cancro têm sofrido um grande aumento tendo-lhe sido atribuídas 600.000 mortes em 2017. Os tratamentos atualmente disponíveis incluem intervenção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia, os quais estão associados a elevada toxicidade e morbidade. O sistema imunitário de doentes oncológicos está deprimido, nomeadamente devido ao desenvolvimento de mecanismos imunosupressores mediados pelas próprias células tumorais. A imunoterapia visa a ativação e modulação deste sistema imunitário, idealmente tendo em vista a destruição de células que expressem marcadores específicos, evitando desta forma que as células saudáveis sejam afetadas. O desenvolvimento de vacinas à escala nanométrica são ferramentas promissoras para a estimulação da resposta imunológica contra o cancro, tendo em vista o combate dos mecanismos de imunossupressão associados a esta doença. As nanopartículas (NP) permitem aumentar a estabilidade e, consequentemente, o tempo de semi-vida de antigénios e adjuvantes, bem como proporcionar a libertação controlada dos mesmos, assegurando uma constante estimulação da resposta imunológica. Este estudo teve como objetivo sintetizar e otimizar NP adequadas ao transporte de antigénios e imunomodeladores para células dendríticas (DC). Para tal, procurou-se tirar partido da hidrofobicidade do polímero poli(ε-caprolactona) (PCL), propriedade esta relacionada com maior internalização destes transportadores por parte de células apresentadoras de antigénios. O método de dupla emulsão-evaporação de solvente foi usado para produzir NP poliméricas biodegradáveis a partir de uma mistura de três polímeros de poliéster alifáticos: i) poli(ácido lático) (PLA); ii) poli(etileno glicol)-poli(ácido lático-co-glicólico) (PEG-PLGA) e iii) poli(etileno glicol)-poli(ε-caprolactona) (PEG-PCL). Deste modo, desenvolveram-se dois tipos de NP: 1) constituída por PLA/PLGA-PEG/ PCL-PEG no ratio 6:2:2; e 2) constituídas somente por PCL-PEG. Tanto o PLA quanto o PLGA são poliésteres alifáticos amplamente estudados na formulação de sistemas de transporte de biomoléculas devido à sua biocompatibilidade e biodegradação. O PCL é um poliéster semi-cristalino hidrofóbico, biodegradável, biocompatível, bioabsorvível, facilmente sintetizado com propriedades controladas e de baixo custo. Os dois tipos de NP desenvolvidas apresentavam um diâmetro médio próximo de 200 nm, carga superficial neutra, esféricas, e elevada capacidade de carga, relativamente à proteína modelo ovalbumina. Deste modo, ambos os tipos de NP apresentavam propriedades fisicoquímicas adequadas ao transporte de imunomodeladores a DC. Porém, apenas as NP constituídas por 60% (m/m) PLA, 20% (m/m) PLGA-PEG e 20% (m/m) PCL-PEG 20% foram extensivamente internalizadas pelas DC. Assim sendo, esta será a nanovacina que será posteriormente utilizada em estudos futuros tendo em vista a avaliação do seu impacto na ativação de diferentes subpopulações de DC, bem como no desenvolvimento de tumores in vivo.The incidence and mortality associated with cancer has been largely increasing and in 2017 over 600,000 deaths were attributable to cancer. Currently treatments for this disease include surgical intervention, radiation and chemotherapeutic drugs that are associated with high toxicity and morbidity. The immune system of oncologic patients is supressed, namely due to development of many evasion mechanisms by mutated cells. Immunotherapy aim the activation and modulation of the immune system, ideally to destroy cells that express specific antigens, thus avoiding harming healthy cells. The development of vaccines at nano scale are promising tools for stimulation of an immune response aiming to overcome cancer immune evasion mechanism. NP aim to improve stability, hence, the circulation semi-life of antigens and adjuvants, as well provide a controlled release kinetic assuring a constant stimulation of an immune response. This study aimed to synthesize and optimize NP suitable for the transport of antigens and immunomodulators to dendritic cells (DC). To this end we sought to take advantage of the polymer poly(ε-caprolactone) PCL hydrophobicity, property related with higher internalization of this carriers by antigen presenting cells. The double emulsion-solvent evaporation method was used to produce biodegradable polymeric NP from a blend of three aliphatic polyester copolymers: i) poly(lactic acid) (PLA); ii) pegylated poly(lactic-co-glycolic acid) (PEG-PLGA) and iii) pegylated poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone) (PEG-PCL).Two different NP were formulated: 1) composed by PLA/PLGA-PEG/PCL-PEG in a ratio 6:2:2; and composed by only PCL-PEG. Both PLA and PLGA have been widely study for formulation of biomolecules delivery systems due to their biocompatibility and biodegradation properties. PCL is a semi-crystalline polyester hydrophobic, biodegradable, biocompatible, bioresorbable, easily synthesized with controlled properties and low cost. The two types of NP developed presented a maximum average size of 200nm, neutral surface charge, spherical surface, and high loading capacity of model antigen, ovalbumin. That way, both NP presented physiochemical characteristics suitable for immunomodulators transport. However, only NP composed by 60 (m/m) PLA, 20 (m/m) PLGA-PEG and 20 (m/m) PCL-PEG demonstrated a high internalization profile by DC. Therefore, this will be the nanovaccine that will be used in future studies to evaluate its impact on the activation of different DC subpopulations, as well as the development of tumors in vivo.Hospital São Francisco Xavier; Farmácia Central de Carnaxid