Bimodal probes for imaging of prostate cancer

Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019Prostate cancer (PCa) is the most common malignancy found in men affecting one in six and is the second leading cause of cancer-related death in men. Recently, new radioactive probes targeted at the prostate-specific membrane antigen (PSMA) have been introduced, which have revealed a high potential for PCa detection and staging based on nuclear imaging techniques, like Single-Photon Emission Computed Tomography (SPECT) or Position Emission Tomography (PET). In particular, very promising results were obtained for complexes prepared with the 99mTc and 68Ga radiometals and functionalized with a PSMA inhibitor, which includes glutamic acid (Glu) and lysine (Lys) as amino acids linked by an urea bond. The PET or SPECT probes allow the detection of PCa and its metastases through the acquisition of whole body images. However, the use of similar fluorescent probes is more favorable in intraoperative procedures for a more selective excision of tumor tissue. To this end, encouraging results have been described for PSMA inhibitors functionalized with indocyanine green (ICG) dyes. The design of PSMA-specific dual probes containing either a PET or SPECT radionuclide or a fluorophore for optical imaging may simultaneously profit from the advantages of nuclear and optical medical imaging modalities. The main goal of this thesis was the design, synthesis and biological evaluation of bimodal probes, with PET / SPECT and Near‑infrared fluorescence (NIRF) valences for PCa detection, starting from the base structure of 99mTc and 68Ga complexes functionalized with PSMA inhibitors that have already shown clinical relevance and that should be functionalized with fluorophores of the ICG type. In this work it was devised the synthesis of bimodal probes for PCa imaging, wherein the general structure included a PSMA inhibitor (PSMA11), a chelating agent, like (N,N′-Bis[2-hydroxy-5-(carboxyethyl)-benzyl]ethylenediamine-N,N- diacetic acid) (HBED-CC) or pyrazolyl diamine, and a derivative of the fluorophore IR820 (aromatic and aliphatic). Concerning the required organic precursors, a solid phase synthesis strategy allowed the synthesis of the Glu-urea-Lys scaffold needed for PSMA inhibition, while two synthetic approaches were tried out to obtain an aliphatic and an aromatic derivative of IR820. The synthesis of two ligands, suitable for further coupling to the fluorophore and PSMA inhibitor, was successfully achieved in this work: HBED-CC, a two-fold carboxylic acid substituted HBED, was synthesized as the chelating agent for 68Ga, while for labeling with 99mTc and for SPECT imaging a pyrazolyl-diamine ligand was obtained.O cancro da próstata (PCa) é a neoplasia maligna mais comum em homens, afetando um em cada seis, sendo a segunda principal causa de morte por cancro em homens. Recentemente, foram introduzidas novas sondas radioactivas direcionadas ao antigénio de membrana específico da próstata (PSMA), que revelaram um elevado potencial para detecção e estadiamento do PCa com base em técnicas de imagiologia nuclear, como a Tomografia por Emissão de Fotão Único (SPECT) ou a Tomografia por Emissão de Positrões (PET). Em particular, foram obtidos resultados muito promissores para complexos preparados com os radioisótopos 99mTc e 68Ga e funcionalizados com um inibidor de PSMA, cuja estrutura incluí ácido glutâmico (Glu) e lisina (Lys) como aminoácidos ligados por uma ligação de ureia. As sondas radioactivas para PET ou SPECT permitem a detecção do cancro da próstata e das suas metástases, mediante aquisição de imagens de corpo inteiro. No entanto, o uso de sondas congéneres fluorescentes, de preferência na zona do infravermelho próximo (NIR), é mais favorável em procedimentos intraoperativos que visem a excisão, o mais selectiva possível, do tecido tumoral. Para este efeito, foram descritos resultados encorajadores para inibidores do PSMA funcionalizados com fluoróforos do tipo “indocyanine green” (ICG). O desenho de sondas duais específicas para o PSMA, contendo um radionuclídeo para imagiologia PET ou SPECT ou um fluoróforo para imagiologia óptica, poderá permitir aproveitar simultaneamente as vantagens inerentes às modalidades nucleares e ópticas de imagem médica. O principal objetivo desta tese foi a concepção, síntese e avaliação biológica de sondas bimodais (PET/SPECT e NIRF) para detecção do cancro da próstata, partindo da estrutura base de complexos de 99mTc e 68Ga funcionalizados com inibidores do PSMA com relevância clínica e que deveriam ser funcionalizados com fluoróforos do tipo ICG. Relativamente à seleção do radionuclídeo para a síntese das sondas duais, várias possibilidades estão disponíveis para diagnóstico, terapia ou teranóstica. O 99mTc é o radioisótopo mais utilizado em SPECT, enquanto o 68Ga é um radioisótopo com crescente importância para PET, o que justifica seu o interesse na oncologia nuclear, principalmente na detecção do PCa. Vale a pena ressaltar que um dos complexos de 68Ga direcionados ao PSMA já foi clinicamente testado em vários centros europeus de Medicina Nuclear e conduziu a resultados promissores na detecção de PCa e das suas metástases quando comparado a outras sondas PET ou outras técnicas de imagem. Relativamente à valência de imagem óptica das sondas bimodais, a mesma seria conseguida através da conjugação a um fluoróforo NIRF, a heptametina IR820, cuja estrutura apresenta semelhanças com a ICG (único fluoróforo NIRF aprovado pela FDA para uso clínico). O IR820 é estruturalmente semelhante à ICG, mas apresenta maior estabilidade em solução devido à presença de grupos de ácido sulfónico nas duas cadeias laterais que permitem ainda uma melhor solubilidade em água e menor toxicidade através da rápida depuração in vivo. O aumento da estabilidade in vitro do IR820 traduz-se igualmente num aumento da estabilidade in vivo, permitindo obter imagens ao longo de um maior período de tempo. Por estes motivos, o IR820 foi selecionado como o cromóforo NIRF a ser avaliado neste trabalho na concepção das sondas bimodais. Neste trabalho, foi estudada a síntese de sondas bimodais para imagiologia do PCa, em que a estrutura geral visava a inclusão de um inibidor do PSMA (PSMA11), um agente quelante bifuncional (HBED-CC ou pirazolilo - diamina) e um derivado do fluoróforo IR820 (aromático e alifático). Em relação aos precursores orgânicos que foram objecto de estudo, a síntese em fase sólida permitiu obter o scaffold Glu-ureia-Lys necessário para a inibição do PSMA, apesar de ter sido também testada, previamente, a síntese em fase líquida para obtenção do mesmo scaffold, sendo que a mesma não conduziu a resultados promissores uma vez que não foi possível sintetizar o análogo da lisina desejado. Duas abordagens sintéticas foram testadas para obter um derivado alifático e aromático do IR820. A funcionalização do fluoróforo - IR820 - para posterior acoplamento aos ligandos bifuncionais foi testada com recurso a dois linkers contendo uma função amina: 4-aminotiofenol e hexametildiamina. A síntese dos derivados do IR820 envolveu a modificação do ciclohexenil central com um cloro reactivo na posição meso para obtenção dos derivados do IR820. Foi efectuada com sucesso a síntese de dois ligandos bifuncionais. Sintetizou-se o (N,N′-Bis[2-hidroxi-5-(carboxietil)-benzil]etilenodiamina-N,N- ácido diacético) (HBED-CC), um derivado do HBED substituído por dois ácidos carboxílicos que actua como um ligando bifuncional eficiente para o radionuclídeo 68Ga. Um complexo de Fe(III) do ligando HBED-CC foi também sintetizado neste trabalho, o qual pode ser usado diretamente para acoplamento do inibidor do PSMA ou da sonda fluorescente, sem necessidade de inclusão de grupos protectores adicionais. Espera-se que a posterior descomplexação do ferro conduza à obtenção dos produtos desejados. Tendo em vista a marcação com 99mTc e para estudos SPECT foi sintetizado um agente quelante do tipo pirazolilo-diamina. Inicialmente, foi testada a formação de um éster ativado na posição 4- do anel pirazolilo, para a síntese de um composto que ao possuir uma função éster ativado deverá reagir com os grupos amina dos fluoróforos estudados neste trabalho, sendo esperada a formação de uma ligação amida estável. Em relação ao acoplamento entre o ligando pirazolilo-diamina e o derivado aromático do fluoróforo IR820, a síntese proposta não se mostrou eficaz. Esta falha poderá ser explicada pela menor reatividade do derivado aromático do IR820, comparativamente ao derivado alifático. Também é importante considerar que o éster ativado testado poderá hidrolisar na presença de água residual e mesmo durante o armazenamento, de acordo com a experiência dos investigadores do Grupo de Ciências Radiofarmacêuticas (RSG) do C2TN/IST que desenvolveram inicialmente o ligando do tipo pirazolilo-diamina. Durante o desenvolvimento deste trabalho, foram testadas várias técnicas para caracterização e identificação estrutural dos compostos estudados, nomeadamente TLC, ESI-MS, HPLC e RMN de 1H e 13C. Como métodos de purificação recorreu-se a técnicas cromatográficas em coluna (SiO2 ou Al2O3) e também à técnica de HPLC. Deve ter-se em consideração que foram encontradas várias dificuldades na obtenção dos produtos no seu estado puro, apesar de terem sido estudados diferentes métodos de purificação. A necessidade de otimização das sínteses propostas, para maximização dos rendimentos e selecção dos métodos de purificação mais adequados, levou ao atraso na obtenção dos compostos previstos neste trabalho. Por estes motivos, não foi possível obter os compostos finais propostos. No entanto, foi possível obter vários dos precursores necessários para a síntese das sondas bimodais pretendidas. No futuro, e aproveitando a estratégia de síntese desenvolvida para o derivado alifático do IR820, deve-se considerar a otimização dos métodos de síntese e purificação propostos para efectivamente realizar com sucesso a síntese das sondas bimodais e avançar para a sua avaliação biológica, nomeadamente a avaliação dos complexos duais de 99mTc e 68Ga em células de PCa e em modelos animais com tumor induzido. No futuro, assim que os ligandos finais e os complexos radiomarcados estejam disponíveis, será crucial realizar essa avaliação biológica para verificar qual o potencial dos complexos previstos como sondas bimodais para a imagiologia e detecção de PCa.Center for Nuclear Sciences and Technologies (C2TN)/IS