Impact of the modulation of tumor vasculature on cancer vaccine efficacy against colorectal cancer

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019Colorectal cancer (CRC) is the third most common cause of cancer-related deaths and the second most prevalent in the western world. High metastatic relapse rates and severe side effects associated with the adjuvant treatment have urged oncologists and clinicians to find novel and less toxic therapeutic strategies. Considering the limited success of the past clinical trials involving peptide vaccine therapies to CRC, it is necessary to revise our knowledge of the immune system and its potential use in tackling cancer. This project aim to design a multifunctional nanomedicine to effectively modulate the tumor vasculature and the immune cell function against CRC by a combined therapy comprising the administration of two nanoparticles (NP). The peptide vaccine (nanovaccine) was designed to target dendritic cells (DC) and activate them to overcome tumor immune suppression by promoting a specific T-cell proliferation; and the second NP (tumor microenvironment (TME)-targeted NP) target tumor angiogenesis and reconstruct tumor vasculature. CRC cell lines (MC38 and JAWSII) and immune-competent CRC mouse models (C57BL/MC38) allowed the evaluation of the anticancer immune-based activity of these precision-targeted nanomedicines. For this purpose, we produced and characterized poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), poly(2-oxazolines) (Pox) nano-vaccines, containing neo-antigen peptides and immune potentiators. NP presented mean diameters in the range of 187-222 nm, with a narrow size distribution (PdI < 0.2), negative surface charge and spherical shape. The neo-antigens and immune modulators presented high entrapment efficiency (EE) and loading capacity (LC), and no cytotoxic effects on DC and MC38, at 0.5 mg/mL concentration, after 3 h, 6 h, 17 h, 24 h and 48 h of incubation. Following the NP physicochemical characteristics, PLGA-POX-Man NP (nanovaccine) and PLGA-POX-RGD (TME-targetedNP) were selected for further in vivo studies. The combination treatment encompassing the nanovaccine associated with the tumor vasculature regulator (as a small molecule or TME-targeted NP) controlled tumor growth in vivo. High levels of CD8+T cells and low levels of tumor-associated macrophages (TAM) were quantified in the tumors of animals treated with this combination. The intratumor administration of the nanomedicine or animals treated with the nanovaccine alone resulted in higher tumor growth. Altogether, these findings reveal important aspects on the synergism between the modulation of tumor vasculature with cancer nanovaccines against CRC development, including the overall effect on tumor-infiltrating effector immune cells. Therefore, this combination therapy arises as a potential strategy to improve clinical outcomes of CRC treatment.Atualmente, o cancro colo-rectal (CCR) é considerado o terceiro tipo de cancro com maior taxa de mortalidade e o segundo com maior incidência no mundo ocidental. O facto deste tipo de cancro apresentar elevadas taxas de recidiva metastática e efeitos secundários graves associados ao tratamento adjuvante levaram oncologistas e investigadores a procurar novas estratégias terapêuticas com menor toxicidade. Considerando o sucesso limitado dos ensaios clínicos anteriormente publicados, onde foi utilizada uma terapia com vacinas peptídicas para tratar o CCR, existe a necessidade de rever o conhecimento do sistema imunológico e o seu potencial uso no combate contra o cancro. O CCR, sendo um tumor sólido secreta fatores de crescimento pró-angiogénicos que promovem a formação e crescimento de vasos sanguíneos nos tumores, pelo que permitem fornecer às células os nutrientes e efetuar as trocas gasosas, recebendo oxigénio e libertando dióxido de carbono e outros produtos de excreção, possibilitando assim o crescimento exponencial da massa tumoral. O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é considerado o fator de crescimento angiogénico mais potente, pelo que é um fator fundamental e apresenta elevado potencial para a terapia de CCR. Acredita-se que ao se utilizar um anti-VEGF é possível regularizar a vasculatura, inibindo vasos imaturos e ineficientes e promovendo a remodelação dos restantes vasos de modo a promover uma diminuição do volume da massa tumoral. Este processo pode levar a uma diminuição da pressão do líquido intersticial, a um aumento da pressão de oxigênio ou melhorar a entrada do fármaco. Este projeto tem como objetivo formular uma nanovacina para modular a vasculatura tumoral e a expressão de células imunes no CCR. Deste modo foi desenvolvida uma terapia combinada que visa incluir a administração de duas nanopartículas (NPs). A vacina peptídica tem como alvo as células dendríticas (DCs) de modo a ativá-las para superar a inibição imunológica do tumor, promovendo a proliferação específica de células T. Por outro lado, a segunda NP é composta por um siRNA anti-VEGFR3 de modo a inibir a angiogénese e reconstruir a vasculatura do tumor. Recentemente o Axitinib tem apresentado na clínica resultados extremamente promissores em vários tipos de cancro. Este inibidor é uma molécula de pequena dimensão, de administração oral capaz de inibir o VEGFR-1, VGFR-2 e VEGFR-3. Deste modo, durante este projeto foi também testada a combinação da vacina peptídica com o Axitinib. Para tal, produzimos e caracterizámos nanovacinas poli (ácido lático-coglicólico) (PLGA) combinadas com poli (2-oxazolinas) (Pox) como principal matriz polimérica biodegradável da nossa formulação. De modo a promover a interação da nanovacina com as DCs através do receptor CD206, foi adicionado à formulação manose. Posteriormente, foram ainda encapsulados nesta nanovacina os neo-antigénios Adpgk R304M MHC II e MHCI associados ao CCR. O fato de os neo-antigenios serem totalmente desconhecidos ao humano garante que as células T ativas disponíveis contra eles não sejam afetadas pela tolerância das células T centrais. Outra vantagem da expressão dos neo-antígenios tumorais é o facto de apresentarem menor toxicidade associada. Relativamente à segunda NP foi adicionado ácido arginyl-glycyl-aspartic (RGD) uma vez que este péptido está envolvido na modulação da angiogénese no microambiente tumoral. Para além destes polímeros foram encapsulados em ambas as NPs, os ligandos dos recetores Toll-like (TLR), designadamente o CpG ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT) (CpG) e Poly (I:C) HMW (GGGCUACCAUGCCAACUUCTT) (Poly (I :C)), com a função de potenciar a resposta imunitária. De modo a estudar o sinergismo dos tratamentos em estudo, foram utilizadas as linhas celulares in vitro (MC38 e JAWSII), bem como os modelos de ratinhos imunocompetentes (C57BL/6J) inoculados com células do CCR (MC38). Isto permitiu avaliar a atividade anticancerígena e estimuladora do sistema imunitário destas NPs. As NPs poliméricas foram preparadas pelo método de evaporação do solvente de emulsão dupla e caracterizadas posteriormente. A caracterização das NPs foi realizada em termos de tamanho, potencial zeta e morfologia da superfície por Dispersão Dinâmica de Luz, Dispersão Electroforética da Luz e Microscopia de Força Atômica, respetivamente. A eficiência de encapsulação (EE,% (p / p)) e a capacidade de carga (LC, µg / mg) dos agentes incorporados foram quantificadas por fluorescamina, Oligogreen e Picogreen. As JAWSII (DCs) e MC38 foram utilizadas para avaliar a viabilidade celular, citotoxicidade e internalização in vitro através dos métodos MTT, PI e citometria de fluxo. Para os estudos in vivo, ratinhos imunocompetentes (C57BL) inoculados com células MC38 do CCR foram distribuídos aleatoriamente por seis grupos experimentais (n=8). Todos os grupos receberam os respetivos tratamentos nos dias 10, 17 e 24 após a inoculação do tumor. Nos grupos tratados com Axitinib, este foi administrado no dia da imunização e nos primeiros três dias após a mesma. Ao longo do estudo (35 dias), foram avaliados os seguintes parâmetros: variação do peso e crescimento tumoral. No trigésimo quinto dia os ratinhos foram sacrificados e foram recolhidos os tumores e os nódulos linfáticos de forma a avaliar e caracterizar as subpopulações presentes no microambiente tumoral. Com estes resultados esperamos futuramente conseguir modular as subpopulações. As NPs apresentaram diâmetros médios na faixa de 187 a 222 nm, com distribuição não homogénia (PdI