Focusing on the epigenetic control of regulatory T cells

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2018O gene FOXP3, codificado no cromossoma X e principalmente regulado por vias epigenéticas, apresenta um papel fundamental no desenvolvimento de células T reguladoras (Treg), essenciais à manutenção da tolerância imunitária e homeostase, sendo amplamente utilizado como um marcador específico das células Treg. Existem diversas regiões no locus do FOXP3 reconhecidas pela sua importância no controlo epigenético: enhancer, promotor e três Sequências Conservadas de DNA Não Codificante (CNS), CNS 1-3. Especificamente, o promotor e o CNS2, também denominado de Região Desmetilada Específica de células Treg (TSDR), são responsáveis por este controlo através da desmetilação de ilhéus CpG das suas sequências. Diferenças nos níveis de metilação da região TSDR contribuem para a distinção entre células Treg e linfócitos T convencionais (Tcon). A par da região TSDR, verificou-se que o gene CAMTA1, localizado no cromossoma 1, apresentava variações dos padrões de desmetilação semelhantes às verificadas no TSDR, apresentando-se como o outro marcador molecular que poderia contribuir para a distinção entre as duas populações. Disfunções das células Treg e um padrão de elevada metilação do locus do FOXP3, têm sido correlacionados com doenças autoimunes e alergias. Notar ainda que as mulheres apresentam uma maior suscetibilidade para doenças autoimunes comparativamente aos homens, o que poderá ser explicado pela inativação do cromossoma X. Propôs-se comparar os padrões de desmetilação do promotor do FOXP3, TSDR e do gene CAMTA1 entre células Treg e Tcon de homens e mulheres saudáveis. Foram isoladas células T CD4+ a partir de sangue periférico, tendo sido sujeitas a citometria de fluxo (FACS) e separadas células Treg naïve CD4+CD25brightCD127low FOXP3+CD45RA+CD15s- e células Tcon CD4+D25lowCD127+. O DNA genómico, após tratamento com bissulfito, foi amplificado por PCR, clonado em vetores pGEM-T e sequenciado. As sequências foram analisadas e os níveis de metilação estabelecidos. Foi demonstrado que, quer em dadores do sexo feminino quer do sexo masculino, a região do gene CAMTA1, nas células Treg, apresentou um padrão consistente de maior desmetilação comparativamente ao das células Tcon. Por outro lado, resultados inconsistentes e não descritos até à data foram apresentados para o promotor do FOXP3 e TSDR. O gene CAMTA1 apresentou ainda dois padrões diferentes de desmetilação nas células Treg: desmetilação das primeiras oito/dez posições CpG e desmetilação do segundo e décimo primeiro CpG.Deste modo, a desmetilação do gene CAMTA1 poderá ser um marcador molecular adicional mais fidedigno para a distinção entre células Treg e Tcon quando a expressão de FOXP3 possa estar afectada. No futuro, será fundamental estudar os padrões de metilação em dadores com doenças autoimunes ou alergias com o objetivo de compreender o impacto que quer estas condições clínicas quer a inativação do cromossoma X poderão ter no padrão de metilação do locus do FOXP3 comparativamente à possível independência do gene CAMTA1 para com as condições supramencionadas.FOXP3, encoded on X chromosome and mainly regulated epigenetically, plays a critical role in the development of regulatory T cells (Treg), essential for maintenance of immune tolerance and homeostasis, and is a widely used Treg-specific marker. Several regions on FOPX3 locus, such as enhancer, promoter and three Conserved Noncoding DNA Sequences (CNS 1-3) were identified as important for epigenetic control. Specifically, promoter and CNS 2, also known as Treg Specific Demethylated Region (TSDR), contribute to FOXP3 expression via demethylation of their CpG islands. Differences in TSDR methylation levels can help distinguish Tregs from conventional T lymphocytes (Tcon). In addition, CAMTA1, encoded on chromosome 1, was shown to be the only other molecular marker that may help differentiate these T cell populations as its demethylation pattern is somewhat similar to that of TSDR. Currently, studies correlate autoimmune diseases (AID) and allergies with decreased function of Tregs and higher methylation levels of FOXP3 locus. Interestingly, females are more susceptible than males to AID which has been suggested to be due to X chromosome inactivation. The aim of this study was to compare the methylation pattern of FOXP3 promoter, TSDR, and CAMTA1 between Tregs and Tcons of random healthy male and female donors. CD4+ T cells, isolated from peripheral blood, were sorted into CD4+CD25brightCD127low FOXP3+CD45RA+CD15s- naïve Treg cells and CD4+CD25lowCD127+ Tcon cells by FACS. Bisulphite converted genomic DNA was PCR-amplified, cloned into pGEM-T vector and sequenced. Sequences were analysed and levels of methylation defined. We demonstrate that donors of both genders have higher demethylation levels in CAMTA1 in Tregs than in Tcons compared to previously undescribed methylation patterns of FOXP3 promoter and TSDR. CAMTA 1 showed two different patterns of demethylation in Tregs: demethylation of the first eight-ten CpGs or demethylation of CpGs 2 and 11. In conclusion, CAMTA1 seems to be a more reliable marker differentiating between Tregs and Tcons. In future, methylation patterns of male and female donors with AID and allergies must be analysed to understand the impact of both X chromosome inactivation and clinical conditions in the methylation of FOXP3 locus and compared to that of CAMTA1 gene region