Cingulate – hippocampal interactions during memory-guided behaviour

Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica (Radiações em Diagnóstico e Terapia) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020Spatial working memory (SWM) – the ability to store and process spatial information during a short period of time – is essential to successfully perform memory-guided choices. While dorsal hippocampus (dHIPP) has long been proven to be necessary for the formation of spatial memories, few studies have recently shown activity synchronization between this brain region and anterior Cingulate Cortex (CG) as rodents approach choice points in a spatial decision-making task. Moreover, this coherence may be related with transfer of spatial information to successfully achieve the optimal response. However, more studies focusing on dHIPP and CG are needed to determine their relevance for memory-guided behaviours. In this master project, I aimed to manipulate dHIPP and CG neural activity while rats are performing a SWM dependent task named delayed nonmatching-to-position (DNMP) task. Here, we developed experimental protocols to 1) perturb dHIPP and CG neural activity using DREADDs, design muscarinic receptor exclusively activated by CNO, and 2) disrupted CG neural activity in specific moments of the task using optogenetics. Preliminary results from the DREADDs experiments show that inactivating dHIPP and CG result in modifications of rodent running speed at specific epochs of the task. In the optogenetic experiment, we successfully implemented an experimental environment that provides intra-cerebral light stimulation conditioned to each DNMP phase. Using this technique, a performance decrease in experimental animals was observed when stimulation occurred during choice phase, which might reveal the necessity of dHIPP-CG interaction to perform memory-guided choices. This work provides tools to, in the future, use experimental designs in which cingulate-hippocampal communication is perturbed using precision optogenetic manipulation and evaluate behavioural modifications.A memória de trabalho espacial (SWM) - capacidade de armazenar e processar informações espaciais durante um curto período de tempo - é essencial para executar com sucesso as escolhas guiadas pela memória. Contudo, embora a memória seja um dos principais impulsionadores deste tipo de comportamentos, a base neuronal na qual a memória de trabalho espacial é usada na tomada de decisões não é totalmente conhecida. Inúmeras evidências mostram que o hipocampo, nomeadamente o hipocampo dorsal (dHIPP), desempenha um papel crucial no processamento de informação espacial, com decréscimo de desempenho de roedores em tarefas dependentes da memória do trabalho quando esta área cerebral é desativada. Ao longo dos anos, porém, a interação de dHIPP com outras regiões cerebrais tem sido amplamente explorada. Recentemente, estudos apontam para uma modulação dos neurónios do córtex cingulado anterior (CG) pelas oscilações teta (4Hz – 10Hz) do dHIPP enquanto ratos executam uma tarefa dependente de SWM. Para além disso, a coerência entre estas duas regiões aumenta à medida que os ratos se aproximam de momentos de escolha. Com base nestes resultados, foi colocada a hipótese de que o CG recebe informações do dHIPP durante estes mesmos momentos e que essas informações podem ser usadas para suprimir respostas inadequadas e para avaliar as opções disponíveis. Contudo, são necessários mais dados comportamentais para compreender melhor esta hipótese. Assim, este trabalho consistiu em testar a importância do dHIPP e CG na codificação da informação espacial. Para tal, foi utilizado um paradigma dependente da memória de trabalho espacial denominado Delayed Non-Matching to Position (DNMP) num labirinto em forma de T, utilizando ratos como modelo animal. Numa primeira fase da tarefa, um dos braços do labirinto é bloqueado e o animal é direcionado para o outro braço, recebendo uma recompensa no seu final. Após um período de espera de 30s no início do labirinto, o rato deve evitar o braço anteriormente visitado, sendo recompensado ao escolher o braço alternativo. De forma a testar a importância de dHIPP e CG ao realizar esta tarefa, foram usadas duas técnicas de manipulação designadas por DREADDs (do inglês – Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs) e optogenética. Os DREADDs correspondem a recetores modificados ativados exclusivamente por atuadores químicos sintéticos e não pelos seus ligandos naturais. Neste projeto, foi usado hM4D(Gi), uma versão modificada do recetor muscarínico M4 ligado à proteína G, que pode ser ativado após a interação com o ligando sintético clozapina-N-óxido (CNO). Deste modo, é possível a inibição da atividade neuronal do dHIPP e CG e verificar qual o desempenho comportamental dos ratos. Durante 10 dias consecutivos, foram administradas injeções intraperitoneais de CNO e salino, em dias alternados, 90 minutos antes do início das sessões comportamentais. Os níveis de desempenho assim como os tempos necessários para percorrer cada divisão do labirinto nas sessões de CNO e de salino foram analisados de acordo com a classificação de cada ensaio (correto ou incorreto) em cada fase da tarefa. Os resultados demonstram que a administração de CNO e consequente inibição neuronal do dHIPP não resultam na diminuição dos níveis de desempenho da tarefa comportamental. Contudo, é visível um efeito da substância no tempo que os animais demoram a executar épocas cruciais da tarefa, nomeadamente para percorrer a porção central do labirinto para a fase de amostra e a porção total na fase de teste nos ensaios incorretos e na porção central do labirinto em ambas as fases da tarefa nos ensaios corretos. Estes resultados demonstram que a inativação desta região cerebral leva a uma modificação comportamental dos roedores ao realizarem a tarefa, relativamente ao tempo em que permanecem em cada um dos segmentos do labirinto. No entanto, após análise dos resultados dehistologia, apenas o segundo animal possuía expressão expectável de hM4D(Gi) nos dois hemisférios no dHIPP, enquanto que o primeiro animal possuía expressão em apenas um dos hemisférios, interferindo assim na interpretação dos resultados desta experiência. O segundo estudo piloto com inibição do CG através do uso de DREADDs revelou alterações significativas ao nível do tempo para percorrer a porção intermédia na fase de amostra e o braço central na fase de teste, ambos nos ensaios incorretos. Apesar deste estudo ter sido realizado apenas num animal, os resultados corroboram a hipótese de que o CG seleciona a informação que é relevante para concluir determinada ação e que a sua inativação leva a que o animal demore mais tempo para selecionar a sua escolha (por exemplo, para qual dos braços deverá seguir na fase de teste). A segunda técnica de manipulação usada – optogenética – consiste na introdução de canais e bombas nas células de interesse cuja ativação é alcançada através da libertação de luz. Para tal, foi usada eNpHR3.0, uma bomba de cloro que, através da absorção de fotões com um comprimento de onda correspondente à luz amarela (589 nm), provoca a hiperpolarização dos neurónios que possuem esta bomba – neste caso, à inibição do CG. Como esta técnica ainda não se encontrava implementada no laboratório, construímos uma configuração experimental em que é possível a estimulação com luz condicionada a determinadas regiões do labirinto e, consequentemente, a cada fase da tarefa dependente de SWM. Os níveis de desempenho foram comparados de acordo com cada condição de estimulação: não estimulação, estimulação na fase de amostra, 30s de espera, teste e estimulação em todo o ensaio. Os resultados associados a esta terceira experiência demonstram níveis de desempenho mais baixo nos animais que expressavam eNpHR3.0 quando a estimulação ocorria na fase de teste comparativamente com o animal controlo. Esta observação pode confirmar a hipótese de que, com a inibição neuronal do CG na fase de escolha, a informação espacial transferida pelo dHIPP não é usada pelo CG para instruir qual o melhor trajeto a seguir, refletindo-se na escolha errada do braço do labirinto. Através de uma análise dos tempos necessários para percorrer cada porção do labirinto em diferentes momentos de estimulação, o aumento do tempo na porção total e central durante a fase de teste como resultado da estimulação no braço total pode corroborar a hipótese anteriormente colocada através do uso de DREADDs de que a inativação do CG leva a que o animal demore mais tempo para selecionar a sua escolha. Juntos, estes resultados podem revelar uma relevância direta do dHIPP e CG para a realização desta tarefa e que ambas as regiões podem desempenhar um papel no processamento de informação espacial em comportamentos guiados pela memória. Neste projeto, procurou-se aprofundar a importância do dHIPP e CG para a realização de uma tarefa que é dependente da memória de trabalho espacial. Os resultados preliminares nesta dissertação visam servir como base para futuras experiências com o objetivo de identificar e esclarecer qual o papel da interação dHIPP-CG para a realização de escolhas dependentes da memória durante a navegação espacial