Micro and macroevolution of multidrug resistant Klebsiella pneumoniae plasmids

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Klebsiella pneumoniae é uma bactéria Gram-negativa pertencente à família Enterobacteriaceae. Esta é responsável por um número significativo de infecções hospitalares em todo o mundo, afectando essencialmente grupos que compreendem, entre outros, indivíduos imunocomprometidos ou com certas outras infecções e doenças. Apesar de os antibióticos constituírem uma arma essencial para o combate deste tipo de infecções, a notável plasticidade genética destas bactérias leva à rápida emergência de estirpes resistentes a antibióticos. K. pneumoniae é uma bactéria frequentemente multi-resistente (MDR), isto é, resistente a três ou mais classes de antibióticos. O aumento da incidência de casos com infecções hospitalares envolvendo estirpes MDR produtoras de β-lactamases de espectro alargado (ESBLs) e carpabenemases constitui um motivo de preocupação crescente, já que estas se encontram associadas a elevadas taxas de morbilidade e mortalidade. A resistência a antibióticos pode estar associada a mecanismos intrínsecos, ou pode ser adquirida por mutações em genes no cromossoma associados ao mecanismo de acção de antibióticos ou pela transferência horizontal de genes de resistência. Este último mecanismo é mediado por elementos móveis, dos quais se destacam os plasmídeos. Os plasmídeos podem ser transmitidos entre bactérias por conjugação (transferência de DNA mediada por canais que unem a célula dadora, com o plasmídeo, e a célula receptora, que recebe o plasmídeo) ou transformação (entrada de DNA livre no exterior da bactéria). A replicação dos plasmídeos é regulada pelo seu replicão, uma curta sequência de DNA com a origem de replicação e genes que codificam para proteínas envolvidas no início da replicação. No passado, pensava-se que as bactérias não podiam conter plasmídeos com o mesmo tipo de replicão, um fenómeno designado “incompatibilidade plasmídica” usado para a classificação de plasmídeos em vários grupos Inc; todavia, alguns estudos têm vindo a questionar este conceito. Certos grupos Inc são restritos a espécies ou géneros de bactérias específicos, enquanto que outros apresentam uma maior amplitude quanto ao seu hospedeiro, podendo disseminar-se por várias famílias de bactérias. A sequência e estrutura do replicão, bem como a presença de vários replicões no mesmo plasmídeo (designados plasmídeos multireplicão) são os factores mais importantes na determinação do leque de hospedeiros capazes de albergar um plasmídeo. A diversificação e evolução dos plasmídeos é mediada por outros elementos móveis: transposões (sequências de DNA capazes de saltar de um ponto para outro do cromossoma, do cromossoma para o plasmídeo ou entre plasmídeos), transposões conjugativos (com características estruturais e funcionais mistas dos plasmídeos e dos transposões) e integrões (responsáveis pela captura e integração de cassetes génicas por eventos de recombinação). Por serem elementos importantes na evolução microbiana e na transferência de genes de resistência a antibióticos, o principal objectivo deste trabalho foi a análise e caracterização molecular de plasmídeos. Este estudo consiste no maior projecto de sequenciação de isolados clínicos de K. pneumoniae em Portugal. No total, 183 isolados de K. pneumoniae obtidos em diferentes hospitais de Lisboa ao longo de 36 anos foram sequenciados por uma plataforma de segunda geração (Illumina). Nesta fase inicial, averiguámos quais os replicões mais prevalentes, a sua distribuição temporal e a sua associação com certos STs. Os resultados obtidos mostram que o replicão IncFIB é o mais frequente na maioria dos STs destes isolados portugueses e reportam uma tendência para o aumento da sua prevalência nos últimos anos. Adicionalmente, estes resultados apontam para a forte disseminação temporal deste replicão em Portugal e em diversos STs. Por outro lado, outros replicões como IncR ou IncFII demonstram uma diminuição da sua prevalência ou valores estáveis ao longo do tempo. Posteriormente, sete isolados de STs distintos foram escolhidos para uma análise mais detalhada dos seus plasmídeos e do respectivo conteúdo génico através de sequenciação genómica completa por uma plataforma de terceira geração (PacBio). Cinco destes isolados são MDR e apresentam resistência concomitante à cefotaxima, mas nenhum mostrou ser resistente ao carbapenemo imipenemo. A assemblagem dos contigs foi realizada de duas formas: uma usando somente as reads obtidas por PacBio, e uma abordagem híbrida em que se combinaram as reads obtidas pelas duas plataformas de sequenciação. Foram obtidos um total de 20 plasmídeos, maioritariamente compreendendo replicões do tipo IncFII(K) e IncFIB(K). Dois dos isolados contêm megaplasmídeos do mesmo grupo de incompatibilidade; tratam-se, porém, de plasmídeos que são multireplicão, e em ambos os casos estes replicões encontram-se associados a divergência nucleotídica e terão acumulado polimorfismos potencialmente envolvidos na alteração da especificidade dos mecanismos de incompatibilidade, ou simplesmente à sua inactivação. A maioria dos plasmídeos aqui estudados contém genes que codificam para proteínas membranares, sobretudo transportadores ABC e proteínas envolvidas na mediação da conjugação. Para além destes, outros foram detectados, nomeadamente genes que codificam para proteínas fágicas, mobilização de ferro e resistência ao mercúrio. Quanto aos genes de resistência a antibióticos, as classes mais frequentemente encontradas são β-lactamases e proteinas de resistência aos aminoglicosídeos. Notavelmente, neste estudo foi descrita pela primeira vez a β-lactamase LAP-1 num isolado de K. pneumoniae; esta foi ainda a primeira detecção da enzima LAP em Portugal. O contexto genético deste gene foi descrito neste trabalho, juntamente com o contexto genético dos genes arr-2, conferindo resistência ao antibiótico rifampicina a um dos isolados, e blaCTX-M-15, a única ESBL presente nestes plasmídeos e associada a um transposão Tn3 com uma estrutura semelhante em todos eles. De seguida, a diversificação estrutural dos megaplasmídeos deste estudo foi estudada por comparação com plasmídeos da base de dados pAtlas, obtidos de isolados da família Enterobacteriaceae e de regiões geográficas diversas. Os nossos resultados mostram que os plasmídeos IncFIB são os mais conservados não só em Portugal mas noutras regiões do globo, o que nos diz que a vasta disseminação de resistência a antibióticos se encontrará intimamente ligada a plasmídeos com este replicão. Destaca-se ainda a detecção de plasmídeos estruturalmente idênticos aos descritos neste estudo em diversas regiões geográficas e backgrounds genéticos, atestando assim o seu enorme potencial para a disseminação global de genes de resistência a antibióticos. Por forma a corroborar a capacidade destes megaplasmideos de se disseminarem em múltiplos hospedeiros, foram realizados ensaios de conjugação entre dois dos sete isolados clínicos de K. pneumoniae e as seguintes bactérias de Gram-negativo: Acinetobacter baumannii, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. O único receptor que foi possível conjugar foi E. coli. Usando o primeiro dador, obtivemos três conjugantes, os quais ganharam resisência às cefalosporinas de terceira geração cefotaxima, ceftazidima, e ao β-lactâmico amoxicilina na presença no inibidor ácido clavulânico. Usando o segundo dador, obtivemos dois conjugantes, os quais ganharam resistência aos antibioticos cefotaxima, ceftazidima, ciprofloxacina, gentamicina, tetracilina, sulfametoxazol-trimetoprim e ao β-lactâmico amoxicilina na presença do inibidor ácido clavulânico. No entanto, os níveis de resistência a estes antibióticos diferem entre estes últimos dois transconjugantes. Por forma a esclarecer estas diferenças, realizaram-se ensaios usando o inibidor de bombas de efluxo reserpina. Estes ensaios demostraram que as diferenças observadas não se devem exclusivamente a mecanismos de efluxo, uma vez que as reduções observadas ao nível das concentrações mínimas inibitórias de determinados antibióticos não foram significativas. Na fase final, procurámos estudar a estabilidade de alguns dos megaplasmídeos aqui caracterizados na ausência da pressão selectiva de um antibiótico. Os resultados obtidos demonstram que, apesar do seu tamanho e da ausência desta pressão, todos os isolados à excepção de um apresentam uma elevada estabilidade plasmídica. Estes resultados sugerem que o extenso conteúdo génico presente nestes megaplasmídeos poderá acarretar outras vantagens selectivas para o hospedeiro, contribuindo desta forma para a presença e persistência de genes de resistência a antibióticos na ausência de uma pressão selectiva e no meio ambiente.Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative bacillus from the Enterobacteriaceae family responsible for a significant number of community-acquired infections worldwide. K. pneumoniae strains are frequently multidrug resistant (MDR), that is, resistant to three or more classes of antibiotics. The increasing emergence of K. pneumoniae strains producing extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) and plasmid-encoded carbapenemases has become a major cause of concern worldwide due to the lack of alternative therapeutic options and the high morbidity and mortality rates associated with infections by these strains in hospital settings. Antibiotic resistance is often acquired by the horizontal transfer of resistance genes on mobile elements like plasmids. Plasmids are a key vehicle for bacterial evolution and they promote the lateral gene transfer between different genera of bacteria via conjugation and transformation. Their replication is regulated by the basic replicon. In the past it was believed that it was not possible for plasmids with the same replicon type to coexist in the same cell. Based on this concept of incompatibility, plasmids were sorted into different Inc groups. Additionally, antimicrobial resistance genes can be mobilized through the acquisition of mobile elements in plasmids, such as transposable elements, conjugative plasmids and integrons. To characterize plasmid diversity among K. pneumoniae, 183 K. pneumoniae clinical isolates from Portugal were subjected to whole genome sequencing by a second generation platform (Illumina), and their plasmidome was characterized. Herein, IncFIB is the most prevalent replicon from the Inc family, with its prevalence showing a slight increasing trend over the last 20 years. Seven of these isolates, five of which classified as MDR, were further subjected to whole genome sequencing by a third generation platform (PacBio), producing long-read sequence data. In total, the complete sequence of 20 plasmids was obtained. The majority of these plasmids carry genes coding for β-lactamases and aminoglycoside resistance. CTX-M-15 was the only ESBL enconded on a plasmid and it always found on a similar Tn3 transposon. Moreover, this study allowed the identification of blaLAP-1 on a K. pneumoniae isolate for the first time. To investigate the structural diversification of the plasmids herein characterized, we then compared their scaffold with the scaffold of a global datset of plasmids available at the pAtlas database. Our results show that IncFIB(K) plasmids are the most conserved Inc-type plasmids while simultaneously identifying the same plasmidic scaffolds across distinct genetic backgrounds and geographically distributed isolates. The mobilization of these drug resistance plasmids to other Gram-negative bacteria responsible for hospital-associated infections through conjugation and transformation was also assessed. IncF plasmids were successfully transferred by conjugation to Escherichia coli but not to Acinetobacter baumannii or Pseudomonas aeruginosa.. Additionally, the transfer of a ColRNAI plasmid to E. coli was possible by transformation. This study comprises the largest ongoing sequencing effort of K. pneumoniae clinical isolates from Portugal. We also demonstrate the horizontal transfer of ESBLs to other Enterobacteriaceae via efficient conjugation by megaplasmids harbouring a diverse genetic content. Moreover, we showed that the gene content of these plasmids, which is not limited to antibiotic resistance, can potentially contribute to high rates of persistence in its host strain even in the absence of the selective pressure of an antibiotic