Study of non-conventional Aspergilli and Penicillia Ochratoxin A producers

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019The continuous growth of the population is pushing the available natural resources to the limit, posing a threat to the balance of the planet. This increase in population means that more food is needed. Consequently, food safety is, nowadays, a matter of interest to the scientific community and world leaders. However, problems related to food/feed contamination have been frequently reported, including those related to fungi. Fungi are diverse, ubiquitous and their role and impact in food security is now an urgent concern. One thing that makes fungi so dangerous is their ability to resist the treatments during the food making process and their ability to produce harmful secondary metabolites like mycotoxins. Mycotoxins are fungal secondary metabolites that can cause severe health issues in either humans or domesticated animals when ingested, inhaled and/or absorbed. From all the mycotoxins reported, some are more studied due to the higher health risks. Ochratoxin A (OTA) is among those and is present in several food/feed products. Aspergillus and Penicillium species are commonly associated with food spoilage and both genera contain species that can produce this toxin. The major OTA producers are P. verrucosum, P. nordicum and A. carbonarius, but more than 20 species of Aspergillus can produce this toxin. However, recent studies reported the presence of OTA in food matrices where known OTA producers are not present. This triggered the scientists involved to try to find the origin of OTA. Based on previous evidence other species like P. crustosum and A. fumigatus are now being considered. Therefore, the main goal of this work was to search for potential OTA producers among P. crustosum and A. fumigatus strains, with different geographic origins, and try to find potential genetic differences at the sub-species level. A set of 28 Penicillium crustosum strains and 7 Aspergillus fumigatus strains, kindly supplied by Micoteca da Universidade do Minho (MUM), and 16 Penicillium crustosum strains, by Colección Chilena de Cultivos Tipo (CCCT), were studied. The Penicillium isolates are from four different countries: 16 from Italy, 16 from Chile, 6 from Portugal and 4 from Tunisia. The Aspergillus strains are all from Portugal, Spain or with unknown origin. Mycotoxin production was analysed by HPLC-FLD and results were compared with a standard sample. In addition, genes associated with OTA production [two ochratoxin polyketide synthase (Penicillium and Aspergillus related), ochratoxin non-ribosomal peptide synthetase and an ochratoxin transport protein] were tested. RAPD-PCR fingerprinting [M13 and (GACA)4] and beta-tubulin gene (BenA) sequencing were used to perform a wide molecular characterisation. Under the studied conditions, and with a HPLC-FLD detection limit of 7.6 ng/ml, preliminary results showed that OTA was not detected for all studied strains. However, regarding the genes associated with OTA production, there were 4 positive strains of P. crustosum for the 3 genes. Genetic differences, based on RAPD fingerprints, between P. crustosum isolates were found allowing the clustering of strains from the same geographic region, except for isolates from Europe. The low number of A. fumigatus strains did not allowed to draw conclusions, although they also presented genetic differences. Sequencing with BenA did not revealed any SNPs. Nevertheless, further studies with a broader array of conditions needs to be considered.O crescimento exponencial da população mundial está a levar ao limite os recursos naturais disponíveis representando um risco para o equilíbrio do planeta. O aumento da população tem como consequência o aumento da necessidade de mais alimentos. Consequentemente, a segurança alimentar é, hoje em dia, uma preocupação para a comunidade científica e para os líderes mundiais. Contudo, problemas relacionados com comida e rações animais contaminadas têm sido frequentemente reportados, incluindo aqueles com fungos. Os fungos são um grupo de organismos eucarióticos, diversos, ubíquos e têm um grande impacto na segurança alimentar. A capacidade de os fungos resistirem aos processos da indústria alimentar, como tratamentos térmicos, e a sua capacidade de produzirem metabolitos secundários prejudiciais, torna-os perigosos contaminantes. Um exemplo desses metabolitos produzidos são as micotoxinas. As micotoxinas quando ingeridas, inaladas e/ou absorvidas podem causar problemas severos de saúde a pessoas e animais. A preocupação com este assunto iniciou-se aquando da morte de cerca de 10000 perus no reino unido, que se deveu a uma contaminação com aflatoxinas. Aspergillus e Penicillium são dois grupos de fungos filamentosos que têm um grande impacto na contaminação alimentar particularmente pela capacidade de produzirem micotoxinas. As micotoxinas mais associadas a estes géneros são aflatoxinas, ocratoxina A, patulina e citrinina. A maior preocupação com estas toxinas é a sua toxicidade aguda e/ou crónica, que pode levar à morte ou a outras patologias. A maioria das micotoxinas são estáveis, resistentes ao calor e podem permanecer mesmo em produtos tratados (por exemplo, produtos pasteurizados). De todas as micotoxinas, a ocratoxina A (OTA) é uma das mais estudadas, devido à sua presença em vários produtos alimentares e também pelos problemas de saúde que pode causar. A OTA foi descoberta em 1965 no Aspergillus ochraceus. É considerada neurotóxica, nefrotóxica, carcinogénica, hepatotóxica e teratogénica, para diversas espécies. Está classificada com o grupo 2B - possivelmente carcinogénica para humanos. Está presente em diversos produtos alimentares como cereais, vinho, queijo e café. De entre os cereais, o centeio, o trigo e a cevada são os que apresentam os maiores níveis de contaminação. Isto representa um problema pois estes cereais são muito usados no fabrico de farinhas e rações destinadas à alimentação de animais. Consequentemente, os animais domésticos são os mais suscetíveis a ter reações adversas devido à presença da toxina, uma vez que estão expostas a ela por mais tempo e com maior frequência. Os maiores produtores de OTA são P. verrucosum, P. nordicum e A. carbonarius, no entanto cerca de mais 20 espécies de Aspergillus são capazes de a sintetizar. A identificação e a quantificação da OTA são comummente feitas por cromatografia líquida de alta eficiência com um detetor de fluorescência (HPLC-FLD). Além disso há genes que estão associados com a ocratoxina A e que podem ser usados como possíveis marcadores genéticos da capacidade de um fungo a produzir. Recentemente, um estudo identificou a presença de OTA em diversas amostras de queijos Italianos. Contudo, não foi possível identificar nenhum dos conhecidos produtores da toxina. Assim, surgiu a dúvida de qual seria a origem da OTA. Baseados em estudos anteriores, P. crustosum e A. fumigatus estão a ser considerados como possíveis novos produtores. Estes fungos são ubíquos e são diversas vezes encontrados em produtos alimentares. São produtores de toxinas, mas apenas foram descritos uma (A. fumigatus) ou duas (P. crustosum) vezes como produtores de OTA. O objetivo principal deste trabalho é procurar potenciais produtores de OTA entre um conjunto de estirpes de P. crustosum e de A. fumigatus (com diferentes origens geográficas) e tentar encontrar potenciais diferenças ao nível da subespécie. Um conjunto de 28 estirpes de P. crustosum e 7 estirpes de A. fumigatus fornecidas pela Micoteca da Universidade do Minho (MUM), e 16 estirpes de P. crustosum, fornecidas pela Colección Chilena de Cultivos Tipo (CCCT), foram estudadas. Os isolados de Penicillium provieram de quatro países e matrizes diferentes: 16 foram isolados de queijos italianos, 16 de merkén do Chile, 6 de diferentes origens em Portugal e 4 de maçãs da Tunísia. As estirpes de Aspergillus são, na sua maioria, de Portugal ou Espanha, no entanto algumas têm origem desconhecida. A produção de ocratoxina A foi avaliada por HPLC-FLD e os resultados foram comparados com um padrão de concentração conhecida. As estirpes de P. crustosum foram cultivadas em meio enriquecido com sal de forma a terem um stress externo que conduza à produção de micotoxinas. Genes relacionados com a produção de OTA (PKS, NRPS e um transportador) foram também procurados. Adicionalmente foi feito um estudo genético complementar. Apesar de todas as estirpes terem origem em coleções de culturas, o que à partida valida a sua identificação, o gene da beta tubulina foi amplificado. Uma vez que o estudo envolve uma panóplia de estirpes da mesma espécie, principalmente em P. crustosum, com origens geográficas diferentes, há uma possibilidade de nessas estirpes terem ocorrido processos de especiação e haver espécies crípticas por revelar. Espécies crípticas são espécies que são morfologicamente idênticas, no entanto apresentam diferenças genéticas. Para complementar este estudo foram feitas análises de perfis genómicos (fingerprinting) usando pequenos primers: M13 e (GACA)4. Nas condições testadas, tendo a HPLC um limite de deteção de 7,6 ng/ml, os resultados preliminares mostraram que não se detetou produção de OTA para nenhuma das 51 estirpes. Os cromatogramas obtidos de cada estirpe foram comparados com o cromatograma padrão, onde foi possível observar um pico aos 13 min. No entanto, em relação aos genes relacionados com a biossíntese de OTA os resultados foram mais promissores, exceto para o gene relacionado com a produção de OTA em Aspergillus (Acpks). Para esse gene apenas o controlo positivo foi amplificado e não em nenhuma das estirpes em estudo. Os restantes genes estavam relacionados com Penicillium [otapks (≈500 bp); otanps (≈700bp) e otatra (≈420 bp)]. Para estes genes, 8% estirpes amplificaram todos os genes (sendo todas do Chile), 16% amplificaram somente otapks; 10% otapks e otatra, 8% otanps e otatra; 45% apenas otatra; e 14% não amplificaram nenhum gene. O facto de haver espécies a amplificarem os três genes testados é um indicador que estas podem ter a capacidade de produzir OTA. Além disso a grande diversidade de padrões verificados mostra que as estirpes são distintas entre si. O estudo com os primers de fingerprinting de onde se obtiveram perfis genéticos e com os quais foram construídos dendrogramas mostraram a mesma distinção. Diferentes padrões foram obtidos podendo individualizar cada indivíduo. Além disso, fazendo uma análise aos dendrogramas foi possível verificar que as estirpes chilenas formam um cluster assim como as estirpes da Tunísia. Isto pode demonstrar que a distância geográfica poderá criar processos de especiação. Por outro lado, as estirpes Italianas e Portuguesas não formam nenhum cluster. Estes dois países encontram-se na Europa onde não há muitas restrições de fronteiras. Em relação a A. fumigatus, o baixo número de estirpes, e a falta de informação de algumas delas, não permitiu a formação de clusters, apenas se verificando que também apresentam perfis diferentes. Este foi um estudo preliminar em que não foi possível a quantificação de OTA nem em P. crustosum nem em A. fumigatus. No entanto, os resultados dos genes biossintéticos mostram que algumas das estirpes podem ter a capacidade de a produzir. Também foi possível verificar que RAPD é uma boa técnica de tipificação e que espécies afastadas geograficamente apresentam perfis genéticos diferentes. Não obstante, estudos com métodos adicionais e com diferentes condições precisam ser considerados