Identificação de substâncias dopantes em fluidos biológicos de atletas por LC-MS: definição de critérios de identificação e avaliação da incerteza do exame

Tese de mestrado, Química (Química) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019O Laboratório de Análises de Dopagem (LAD), do Instituto Português do Desporto e da Juventude, IP, utiliza diversas metodologias analíticas para a identificação e, se necessário, quantificação de vestígios de substâncias ativas proibidas, marcadores, ou dos seus metabolitos nos fluidos biológicos. Uma parte significativa do trabalho realizado no LAD envolve a utilização de métodos analítico baseados em determinações instrumentais por cromatografia em fase líquida hifenada com espectrometria de massa. Este trabalho envolveu a definição de critérios estatísticos e a avaliação da metodologia definida pela agência Mundial Antidoping (WADA) para a identificação de compostos por LC-MS após uma adequada preparação da amostra. Esta avaliação é sustentada numa ferramenta estatística implementada numa folha de cálculo de MS-Excel que recorre a simulações Monte Carlo de tempos de retenção e abundâncias iónicas correlacionadas para definir critérios para os parâmetros usados na identificação dos analitos. As simulações baseiam-se no desempenho experimental observado e consideram a distribuição não normal e a correlação das variáveis instrumentais consideradas. O desempenho das identificações foi quantificado pelas taxas de verdadeiros (TP) e falsos (FP) positivos. Para determinar as FP, foram desenvolvidos modelos do ruído do sinal do espectrómetro de massa, uma vez é impossível determinar experimentalmente taxas muitos baixas. As estimativas de TP e FP associadas aos diferentes parâmetros de identificação foram combinadas e apresentadas como a incerteza do exame na forma de uma razão de verosimilhanças (LR). Foi estudada a identificação de treze substâncias dopantes com diversos tipos de atividade biológica. Assim, avaliou-se o desempenho dos exames tendo em conta dois critérios de identificação diferentes: o critério estatístico desenvolvido e o critério de identificação definido pela WADA. Deu-se especial atenção às taxas de falsos negativos (FN), i.e. à probabilidade de não se identificar a presença de uma substância (FN = 1-TP). Os resultados obtidos permitem comprovar que a identificação de todas as substâncias, aplicando os critérios definidos pela WADA estão associadas a baixas taxas de falsos positivos. No entanto, em diversos casos, os critérios de identificação propostos pela WADA produzem elevados FN. Desta forma, a ferramenta desenvolvida pode ser muito útil para auxiliar a utilização dos critérios de identificação regulamentados pela WADA, nomeadamente estimando a probabilidade de o resultado negativo ser falso, o que pode indicar a necessidade da realização de exames replicados ou complementares.The Doping Analysis Laboratory (LAD) of the Portuguese Institute of Sport and Youth, IP, uses various analytical methodologies for the identification and, if necessary, quantification of traces of prohibited active substances, markers, or their metabolites in biological fluids. A significant part of the work done at LAD involves the use of analytical methods based on instrumental determinations by hyphenated liquid chromatography with mass spectrometry. This work involved the definition of statistical criteria and the evaluation of the methodology defined by the World Anti-Doping Agency (WADA) for the identification of compounds by LC-MS after adequate sample preparation. This assessment is supported by a statistical tool implemented in an MS-Excel spreadsheet using Monte Carlo simulations of retention times and correlated ionic abundances to define criteria for the parameters used in analyte identification. The simulations are based on the observed experimental performance and consider the non-normal distribution and the correlation of the considered instrumental variables. Identification performance was quantified by true (TP) and false (FP) positive rates. To determine the FP, mass spectrometer signal noise models have been developed, since it is impossible to experimentally determine very low rates. The estimates of TP and FP associated with the different identification parameters were combined and presented as the examination uncertainty as a likelihood ratio (LR). The identification of thirteen doping substances with various types of biological activity was studied. Thus, the performance of the exams was evaluated taking into account two different identification criteria: the developed statistical criterion and the identification criterion defined by WADA. Was paid particular attention to false negative rates (FN), i.e. to the probability of not identifying the presence of a substance (FN = 1-TP). The results show that the identification of all substances by applying the criteria defined by WADA is associated with low false positive rates. However, in many cases the identification criteria proposed by WADA produce high FN. Thus, the developed tool can be very useful to assist the use of the identification criteria regulated by WADA, namely estimating the probability that the negative result is false, which may indicate the need for replicated or complementary exams