Epitranscriptomic deregulation in bladder cancer: implications for tumour aggressiveness

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019O cancro de bexiga é o nono cancro mais incidente no mundo e a décima terceira principal causa de morte por cancro, de acordo com o estudo GLOBOCAN 2018. A maioria dos casos de cancro de bexiga (> 90%) surge no revestimento interno do trato urinário (urotélio) e são designados por carcinoma de células uroteliais. Os subtipos menos comuns são o carcinoma espinocelular, adenocarcinoma, carcinoma de pequenas células e sarcoma. Adicionalmente, o cancro de bexiga pode ser classificado em não músculo-invasivo e em músculo-invasivo. Este primeiro, é responsável por aproximadamente 75% de todos os cancros de bexiga diagnosticados. Apesar destes tumores, geralmente, não representarem uma ameaça à vida dos doentes, a taxa de recorrência é elevada. Por outro lado, tumores músculo-invasivos, que representam cerca de 25% dos casos, são tumores clinicamente mais agressivos, que podem progredir rapidamente, apresentando capacidade de invadir e metastizar para outros órgãos. Assim, há uma necessidade urgente de compreender os mecanismos de progressão do cancro de bexiga, para assim desenvolver novas estratégias de diagnóstico, bem como abordagens terapêuticas efetivas. Nos últimos anos, o número de estudos na área da genética, epigenética e epitranscriptómica aumentaram drasticamente, principalmente devido ao rápido aprimoramento das tecnologias de sequenciação de alto rendimento de nova geração. CH Waddington, definiu originalmente o termo Epigenética como o estudo de "mecanismos causais pelos quais os genes do genótipo produzem efeitos fenotípicos". Ao longo do tempo, esta definição sofreu algumas alterações, sendo, hoje, definida como “o estudo de alterações hereditárias na expressão génica que ocorrem independentemente das alterações na sequência primária de ADN". Recentemente foram identificados novos mecanismos de regulação da expressão génica, ao nível do ácido ribonucleico (ARN), designado por epitranscriptómica. Esta refere-se ao estudo de modificações químicas, reversíveis, que podem ocorrer quer em moléculas de ARN, quer em ARN não codificante (ncARN) e em ARN mensageiro (mARN). A N6-metiladenosina (m6A), metilação da adenosina na posição nitrogénio-6, é a modificação química interna mais abundante nos mARNs dos seres eucarióticos. Esta modificação ocorre, preferencialmente, na sequência DRACH (onde D indica A/G/U; R indica A/G e H indica A/C/U), sendo especificamente enriquecida próximo do codão stop, nas regiões 3' não-traduzidas e em grandes exões internos. O seu potencial na regulação da expressão génica foi recentemente explorado e sabe-se que, esta modificação pode afetar diferentes vias do mARN, como a transcrição, splicing, exportação do núcleo e tradução. Nas células de mamíferos, esta modificação é catalisada pelo complexo m6A metiltransferase ("writters") e pode ser removida pelas desmetilases ("erasers"). Além disso, existem proteínas que se ligam diretamente à modificação m6A, mediando a sua função. Estas são conhecidas como “readers”. Vários estudos revelaram que a metilação do m6A, bem como das suas proteínas reguladoras, desempenha um papel crucial no processo de tumorigénese em diferentes modelos. No entanto, o envolvimento desta modificação no cancro de bexiga é ainda limitado, sendo, portanto, necessário investigar as suas funções no contexto desta neoplasia. O objetivo do nosso estudo é descobrir o papel da m6A no cancro de bexiga, a fim de perceber quais os mecanismos moleculares subjacentes à agressividade tumoral. A seleção das proteínas reguladoras da m6A mais informativas para o nosso projeto foi realizada pela análise in silico dos dados de ARN-seq de doentes com cancro de bexiga músculo-invasivo, disponíveis na base de dados do TCGA. Esta análise revelou que as principais proteínas reguladoras da m6A desreguladas eram o METTL3, METTL14, VIRMA, WTAP, que formam um “writter complex”, sendo o METTL3 a única proteína com atividade catalítica, o ALKBH5 e FTO, que têm a capacidade de desmetilar o m6A, e o YTHDF3 que tem como função “ler” a marca no citoplasma, determinando se o mARN é traduzido ou degradado. Assim, foi selecionada (n=120) uma série de tecidos de cancro de bexiga primário, sem qualquer tratamento, dos quais 50% são músculo-invasivo e 50% não músculo-invasivo), bem como uma série de tecidos normais. Em seguida, foi realizada quantificação proteica, por imunohistoquímica. Tal serviu para comparar a expressão em tecidos tumorais e tecidos normais, sendo que, dentro dos tecidos tumorais, a expressão diferencial nos músculo-invasivo e não músculo-invasivo também foi avaliada. A METTL3, METTL14, VIRMA, ALKBH5 e YTHDF3 apresentam uma expressão significativamente menor nos tumores por comparação com tecidos normais. Além disso, a METTL3 e a METTL14, que formam um heterodímero estável, apresentam uma redução de expressão significativa nos tumores músculo-invasivo, quando comparado com os não músculo-invasivos. Analisámos a correlação da expressão destas proteínas reguladores e da m6A entre si. Para além disso, observámos que a expressão do reader (YTHDF3) e de todos os writters estudados se correlacionou positivamente com a expressão da m6A. O mesmo foi observado em relação à expressão das erasers. Curiosamente, também foram observadas correlações entre a expressão dos writters e erasers, com exceção da WTAP com ambas as erasers, bem como do VIRMA e do FTO. Assim, estes resultados sugerem que a correlação observada entre os writters e as erasers pode ser explicada através de um feedback compensatório, ou seja, a diminuição dos escritores vai diminuir consequentemente a m6A, levando a uma diminuição das erasers que desmetilam esta modicação. A metilação desta modificação no ARN e a expressão das suas proteínas reguladoras, foi avaliada em linhas celulares de bexiga através do ensaio colorimétrico e Western blot, respetivamente. Uma linha celular normal, SVHUC-1, e sete linhas celulares tumorais foram usadas. Relativamente à modificação da m6A, não foram observadas diferenças significativas nas diferentes linhas celulares. Em relação às proteínas reguladoras, também não se observaram diferenças significativas para a expressão destas entre as linhas celulares testadas, com exceção do METTL14 que apresentou níveis bastantes variáveis, sendo a linha UMUC3, aquela com valores mais elevados desta proteína. Nesta sequência, com o objetivo de induzir in vitro a ablação da expressão do METTL14, foi realizado o knockdown deste gene na linha celular UMUC3, recorrendo ao sistema CRISPR-Cas9. Para avaliar a eficiência desta técnica, realizámos Western blot, onde foi comparada a expressão do METTL14 na linha celular com knockdown e na linha UMUC3 normal. Após confirmar a eficiência da redução da expressão em pelo menos 50% do METTL14, os níveis da modificação da m6A foram avaliados, a fim de perceber a importância desta proteína no complexo. Posteriormente, foram realizados ensaios fenotípicos para determinar o impacto da diminuição da sua expressão na linha celular de cancro de bexiga. Os ensaios in vitro demonstraram que a redução da expressão do METTL14 promoveu uma redução de 50% na modificação da m6A. Destes, os ensaios de viabilidade e proliferação celular, demonstram que a redução de METTL14 aumenta significativamente a viabilidade e proliferação das células de cancro de bexiga. Além disso, verificámos igualmente, que havia um aumento na capacidade de invasão e migração, comparativamente com as linhas controlo. Em sentido inverso, o knockdown do METTL14 traduziu-se numa redução na taxa de apoptose das células tranfectadas. Em resumo, a expressão das proteínas modeladoras da marca m6A encontram-se desregulada no cancro de bexiga. Particularmente, a regulação negativa do complexo METTL3/METTL14 metiltransferase associou-se à progressão do cancro de bexiga não musculo-invasivo para o cancro de bexiga músculo-invasivo. Estudos anteriores indicam que, embora a METTL14 não possua uma função catalítica, é capaz de formar um heterodímero com a METTL3, sendo necessário para a estabilização e função do complexo. Interações específicas entre o domínio METTL14- MTD14 e o domínio do METTL3- MTD3 são necessárias para a atividade catalítica da METTL3. Na mesma linha, descobrimos que a redução da expressão da METTL14 diminui a atividade do complexo writter e, portanto, a capacidade de estabelecer m6A nas moléculas de ARN. Estes resultados sugerem que a METTL14 poderá desempenhar um papel supressor tumoral, estando a redução da sua expressão associada a características celulares tumorais de maior agressividade.N6-methyladenosine (m6A) modification is the most abundant internal chemical modification of mRNAs in eukaryotes. Several studies revealed that m6A RNA methylation and the associated regulatory proteins, play crucial roles in the tumorigenesis processes of numerous types of cancers. However, knowledge of the mechanistic network between m6A and bladder cancer (BC) is limited and therefore it is necessary to investigate the functions of this modification. The aim of our study is to uncover the role of this modification in BC in order to understand the mechanisms associated with tumour aggressiveness. In silico analysis of TCGA data disclosed altered expression of the major m6A regulatory proteins, prompting subsequent validation. M6A, METTL3, METTL14, VIRMA, WTAP, ALKBH5, FTO and YTHDF3 protein expression were evaluated in a series of primary BC (n=120) and normal bladder (n=40) tissues. M6A RNA methylation and respective regulatory proteins expression were also assessed in bladder cell lines. METTL14 knockdown was performed in UMUC3 cell line using CRISPR-Cas9 system in order to study its relevance in bladder carcinogenesis. METTL3, METTL14, VIRMA, ALKBH5 and YTHDF3 showed significantly lower expression levels in tumour compared to normal tissues. Moreover, METTL3 and METTL14 (heterodimeric catalytic core) showed a significant reduction in muscle invasive (MIBC) comparing with non-muscle bladder cancer (NMIBC). No differences were apparent for m6A regulatory proteins’ expression among the tested cell lines, except for METTL14, that presented heterogenous levels of this writer in the different cells comparing with normal cell line. The in vitro METTL14 downregulation promoted a 50% reduction in m6A modification. METTL14 knockdown showed increased cell viability/proliferation, invasion and migration capacity, whereas decreased apoptosis was found in the same cells compared with the control. Our results suggest that METTL14 might have an important role in bladder cancer, and its expression associated with bladder cancer aggressiveness