Análise genotípica e fenotípica de isolados clínicos de Mycobacterium avium-intracellulare

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Nos últimos anos tem-se verificado um aumento do número de casos de doença devido a infeção por micobactérias não-tuberculosas (MNT). Enquanto microrganismos patogénicos oportunistas apresentam uma grande variedade de hospedeiros, podendo infetar seres humanos e outros animais, sendo a sua presença ubíqua em diversas fontes ambientais como o solo, a água, entre outros. No caso do Homem, os indivíduos imunocomprometidos são os mais suscetíveis a infeções por MNT não havendo evidências de transmissão entre indivíduos. Do ponto de vista clínico, estas infeções manifestam-se sobretudo na forma de infeção respiratória podendo também ocorrer infeção em outros órgãos e, sobretudo em indivíduos imunocomprometidos, ocorrer infeção disseminada. O complexo Mycobacterium avium (MAC) é o principal complexo de micobactérias não-tuberculosas, sendo Mycobacterium avium e Mycobacterium intracellulare as principais espécies deste complexo. A espécie M. avium é ainda dividida nas subespécies M. avium subsp. silvaticum, M. avium subsp. hominissuis, M. avium subsp. avium e M. avium subsp. paratuberculosis. A comparação e diferenciação de isolados clínicos de M. avium e de M. intracellulare nem sempre é fácil quer devido à sua proximidade filogenética, quer devido à baixa taxa de crescimento dos isolados destas espécies. Assim, para este fim, recorre-se frequentemente a alguns métodos genéticos, baseados sobretudo na técnica do PCR, e a algumas técnicas fenotípicas das quais se destacam os testes de suscetibilidade a diversos antibióticos. No presente trabalho procurou-se caraterizar a estrutura populacional e os níveis de resistência de um conjunto de isolados clínicos de microrganismos pertencentes ao MAC em Portugal, nomeadamente M. avium e M. intracellulare. Para essa finalidade, começou-se por realizar a identificação de 24 isolados clínicos de M. intracellulare e identificar, ao nível da subespécie, os 22 isolados clínicos de M. avium obtidos de diversos laboratórios e hospitais na região de Lisboa. Procurou-se inicialmente identificar cada um destes isolados através da amplificação de vários loci dentro dos quais se destacam as sequências de inserção IS900, IS901, IS1245 e IS1311. Foram obtidos cinco perfis de amplificação incompatíveis com as espécies aqui estudas sendo que, cinco isolados clínicos de M. intracellulare e dois isolados clínicos de M. avium não poderam ser identificados com recurso a este método, havendo a suspeita que entre os isolados clínicos de M. intracellulare poderia haver isolados pertencentes à espécie M. chimaera, uma vez que esta espécie aparece, devido às limitações do teste GenoType, frequentemente mal identificada como M. intracellulare. Assim, com o objetivo de discriminar entre M. intracellulare e M. chimaera em isolados inicialmente identificados como M. intracellulare por recurso ao teste GenoType, procurou-se de seguida discriminar e avaliar a prevalência de M. chimaera na amostra estudada através da amplificação do gene SR1 (específico de M. chimaera). Verificou-se amplificação deste gene em nove dos 24 isolados inicialmente identificados como M. intracellulare, sugerindo assim que estes isolados devem pertencer na verdade à espécie M. chimaera. Contudo, nenhum destes nove isolados correspondeu aos cinco isolados com os perfis de amplificação das sequências de inserção incompatíveis com a espécie pelo que, seguidamente, se procedeu à amplificação, purificação e sequenciação do locus ITS e do gene hsp65 (este apenas para um grupo menor de isolados). Neste teste foram incluídos todos os 24 isolados de M. intracellulare, três isolados de M. avium e as estirpes de referência M. avium ATCC25291 e 104. A combinação destes métodos apenas não permitiu identificar ao nível da subespécie dois isolados de M. avium tendo ainda sido possível confirmar a identificação de 11 isolados de M. intracellulare. Foi ainda possível verificar que entre os isolados inicialmente identificados como M. intracellulare, nove pertencem à espécie M. chimaera, dois pertencem à espécie M. colombiense e um pertence à espécie M. marseillense. Assim, de todos os isolados clínicos estudados no presente trabalho apenas um apresentou identificação inconclusiva, uma vez que os resultados obtidos para este isolado nos diferentes métodos testados foram inconsistentes. Posteriormente, procurou-se comparar e diferenciar os isolados clínicos através de métodos genotípicos e/ou fenotípicos. A tipagem fenotípica de todos os isolados de M. avium (incluindo as duas estirpes de referência de M. avium) e M. intracellulare foi feita através de testes de suscetibilidade a diversos antibióticos, nomeadamente: claritromicina, etambutol, moxifloxacina, rifampicina, rifabutina e amicacina. Os resultados obtidos foram bastante semelhantes aos obtidos na literatura, tendo a claritromicina e amicacina sido os antibióticos a apresentar a menor percentagem de isolados resistentes e a maior percentagem de isolados sensíveis (70,83 % e 85,42 %, respetivamente). Em contra partida, o etambutol e a rifabutina foram os antibióticos com a maior percentagem de isolados resistentes (70,83 %) tendo a percentagem de isolados sensíveis sido de 4,17 % e 22,92 %, respetivamente. Verificou-se ainda que para a claritromicina, rifabutina e etambutol a maioria dos isolados possui uma CMI acima do pico sérico máximo no ser humano o que sugere, que em caso de infeção no Homem, estes isolados podem permanecer ativos uma vez que o antibiótico não atinge níveis séricos inibitórios. A comparação genotípica foi feita apenas para isolados clínicos de M. avium recorrendo-se à tipagem por MIRU-VNTR e MATR-VNTR. Além da comparação dos isolados, pretendia-se também verificar se os métodos de tipagem genotípica referidos possuem um poder discriminatório suficiente para comparar e diferenciar isolados. A análise de sequências MIRU-VNTR permitiu observar a existência de 15 perfis MIRU-VNTR distintos. Obteve-se um total 11 isolados distribuídos em três clusters tendo os restantes isolados apresentado um perfil único. A tipagem por MATR-VNTR apresentou um poder discriminatório superior uma vez que se verificou a existência de 18 perfis distintos e a distribuição de nove isolados por quatro clusters. A combinação dos dois métodos possibilitou obter o maior poder discriminatório possível, com recurso a estas sequências VNTR, sendo que apenas dois isolados permaneceram em cluster tendo os restantes apresentado perfis únicos. Os resultados obtidos mostraram que tanto a tipagem por MIRU-VNTR como a tipagem por MATR-VNTR possuem um poder discriminatório suficiente para diferenciar a maioria dos isolados, tendo-se obtido o maior poder discriminatório quando os dois métodos foram combinados. Verifica-se então, que amostra de estudo é bastante diversa e possui uma baixa clonalidade uma vez que só dois isolados permaneceram em cluster. A diversidade da amostra ocorreu tanto a nível genotípico como a nível fenotípico tornando assim difícil perceber de que forma estes isolados se encontram relacionados.In recent years there has been an increase in the number of cases of disease of nontuberculous mycobacterial infection (NTM). These mycobacteria are opportunistic pathogenic microorganisms that have a wide variety of hosts, being able to infect humans and animals. They can be found in the most various environments, such as, soil and water. In the case of humans, immunocompromised individuals are the most susceptible to MNT infections, despite not existing any evidence of person-to-person transmission. From the clinical point of view, those infections are mainly manifested at the respiratory level, and may also infect other organs, and in some cases, especially in immunocompromised individuals, disseminated infection may occur. The Mycobacterium avium complex (MAC) is the main nontuberculous mycobacterial complex, being Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare the main species of this complex. The species M. avium is further divided into subspecies M. avium subsp. silvaticum, M. avium subsp. hominissuis, M. avium subsp. avium and M. avium subsp. paratuberculosis. Comparison and differentiation of clinical isolates of M. avium and M. intracellulare is not easy either because of their phylogenetic proximity or the low growth rate of isolates. Thus, for this purpose, some genotypic methods, mainly based on PCR, are frequently used, as well as some phenotypic techniques, such as susceptibility tests to various antibiotics. The present work aimed to characterize the population structure and resistance levels of a set of clinical isolates of microorganisms belonging to MAC in Portugal, namely M. avium and M. intracellulare. To this end, we began to identify 24 clinical isolates of M. intracellulare and to identify, at subspecies level, the 22 clinical isolates of M. avium obtained from various laboratories and hospitals in the Lisbon region. Initially, we sought to identify each of these isolates by amplifying several loci within which the IS900, IS901, IS1245 and IS1311 insertion sequences stand out. Five amplification profiles incompatible with the species studied were obtained. Five clinical isolates of M. intracellulare and two clinical isolates of M. avium could not be identified using this method, and it is suspected that among the clinical isolates of M. intracellulare there could be isolates belonging to the species M. chimaera, as this species appears, due to the limitations of the GenoType test, often misidentified as M. intracellulare. Thus, in order to discriminate between M. intracellulare and M. chimaera in isolates initially identified as M. intracellulare by the GenoType test, we then sought to discriminate and evaluate the prevalence of M. chimaera in the sample studied by amplifying the SR1 gene (M. chimaera specific). This gene was amplified in nine of the 24 isolates initially identified as M. intracellulare, thus suggesting that these isolates should in fact belong to the M. chimaera species. However, none of these nine isolates matched the five isolates with species-incompatible insertion sequence amplification profiles, so the amplification, purification and sequencing of the ITS locus and the hsp65 gene (this one only for a smaller group) were performed. All 24 isolates of M. intracellulare, three isolates of M. avium and the reference strains M. avium ATCC25291 and 104 were included in this test. The combination of these methods alone did not allow the identification of two isolates of M. avium at subspecies level. It was still possible to confirm the identification of 11 isolates of M. intracellulare. It was also possible to verify that among the isolates identified as M. intracellulare, nine belong to the species M. chimaera, two belong to the species M. colombiense and one belongs to the species M. marseillense. Thus, of all the clinical isolates studied in the present work, only one presented inconclusive identification, since the results obtained for this isolate in the different tested methods were inconsistent. Subsequently, we sought to compare and differentiate clinical isolates by genotypic and / or phenotypic methods. Phenotypic typing of all M. avium isolates (including the two reference strains of M. avium) and M. intracellulare was performed by testing the susceptibility to various antibiotics, namely: clarithromycin, ethambutol, moxifloxacin, rifampicin, rifabutin and amikacin. The results obtained were very similar to those obtained in the literature, having clarithromycin and amikacin been the antibiotics with the lowest percentage of resistant isolates and the highest percentage of sensitive isolates (70.83% and 85.42%, respectively). In contrast, ethambutol and rifabutin were the antibiotics with the highest percentage of resistant isolates (70.83%) with the percentage of sensitive isolates being 4.17% and 22.92%, respectively. It was also found that for clarithromycin, rifabutin and ethambutol most isolates have a MIC above Cmax suggesting that in case of infection in humans, these isolates may remain active as the antibiotic does not reach inhibitory serum levels. Genotypic comparison was performed only for clinical isolates of M. avium using MIRU-VNTR and MATR-VNTR typing. In addition to the comparison of isolates, we also intended to verify whether the referred genotyping methods have sufficient discriminatory power to compare and differentiate isolates. MIRU-VNTR sequence analysis showed 15 distinct MIRU-VNTR profiles. A total of 11 isolates were distributed in three clusters and the remaining isolates presented a unique profile. MATR-VNTR typing had a higher discriminatory power as there were 18 distinct profiles and the distribution of nine isolates by four clusters. The combination of the two methods made it possible to obtain the highest discriminatory power possible, using these VNTR sequences, and only two isolates remained clustered while the others presented unique profiles. The results showed that both MIRU-VNTR typing and MATR-VNTR typing have sufficient discriminatory power to differentiate most isolates, and the highest discriminatory power was obtained when the two methods were combined. Thus, it is verified that the study sample is quite diverse and has a low clonality since only two isolates remained in cluster. The diversity of the sample occurred at both genotypic and phenotypic levels, making it difficult to understand how these isolates are related