Functional studies of genetic variants of unknown significance

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Mundialmente a segunda causa mais comum de morte pertence ao cancro, um grupo de doenças relacionada com uma grande instabilidade genómica e que leva a um crescimento descontrolado de células anormais. Incluído na vasta gama de cancros, o cancro da mama está no segundo lugar de cancros mais comuns diagnosticados globalmente, sendo ainda o mais comum entre as mulheres. Dentro de diversos fatores como estilo de vida, dieta, intervenções médicas de longo prazo, sexo e etnia da pessoa e base genética, o fator mais importante que eleva o risco de cancro da mama pertence à história familiar ou predisposição genética. De facto, 5%-10% de casos de cancro da mama são hereditários (HBC) e a maior parte deles estão associados com mutações herdadas nos genes BRCA1 e BRCA2. Estes genes estão envolvidos em ambas as vias de reparação de quebras de dupla cadeia do DNA – união de extremidades não-homólogas (NHEJ) e, a mais importante, recombinação homóloga (HR). Logo, mutações nestes genes, que contribuem para 20%-25% de risco, podem causar deficiência na reparação de DNA, e com isso, células que sofrem sérias lesões, ao não serem reparadas, potencia o aparecimento de cancro da mama. Essas lesões têm diversas origens, que podem ir desde processos metabólicos, como espécies reativas de oxigénio (ROS), até fatores externos como radiação ou agentes químicos. Para evitar isso, é muito importante realizar clinicamente testes genéticos, que podem identificar individualmente ou numa família uma predisposição genética para desenvolver cancro, como mutações em BRCA1 e BRCA2. Hoje em dia já existe tecnologia que permite uma sequenciação mais completa do genoma e que permite fornecer informações a respeito de alteração de regiões de codificação que poderão estar associadas ao cancro. Apesar dos custos desta tecnologia, sequenciação de próxima geração (NGS), serem ainda altos, uma sequenciação de genes baseada nela é melhor escolha para o diagnóstico de alguns pacientes. Contudo, e apesar desta enorme inovação tecnológica, em cerca de 12%-13% dos pacientes testados para mutações BRCA1/2 são detetadas VUS, ou variantes de significado desconhecido, maioritariamente alterações missense, e que portanto, não se sabe se a variante é benigna ou patogénica, o que acaba por gerar problemas significativos na avaliação do risco, aconselhamento e cuidado preventivo. Para ultrapassar este problema, diversos ensaios funcionais estão a ser ou vão ser desenvolvidos para clarificar o estado mutacional da variante e obter dados que possam prever a casualidade da VUS num modelo teórico. Por esse mesmo motivo, e sabendo que a divisão celular pode ser tida como alvo para tratar pacientes com cancro, é muito útil o uso de agentes quimioterapêuticos na construção destes ensaios funcionais. Estes agentes induzem lesões no DNA que são reconhecidas pelos sistemas de reparação e levam à reparação ou morte das células, no entanto de referir, que sendo agentes quimioterapêuticos, apenas causam dano no DNA em altas doses. Contudo, tal como o nome sugere, nas VUS, é totalmente desconhecido se os mecanismos de reparação de DNA são interrompidos aquando de mutações nos genes responsáveis pela sua reparação, como BRCA1 e BRCA2, que por sua vez estão ligados a cancro da mama e ovários. Por esse motivo, portadores de VUS diagnosticados com cancro metastático da mama ou ovário podem não beneficiar de certas terapias, como inibidores de platina ou PARP, que têm como alvo os defeitos do sistema de reparação de DNA, e que são atualmente recomendados para indivíduos com variantes patogénicas de BRCA1 ou BRCA2. Daí ser tão importante a realização de trabalhos, como este mesmo estudo que permite uma avaliação funcional do papel das VUS, previamente identificadas, em resposta a agentes genotóxicos (Doxorubicina). Para possibilitar a execução de um estudo funcional a estas VUS previamente sequenciadas, realizámos uma “prova de conceito” de análise funcional em Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMCs) coletadas por injeção venosa e derivadas de quatro voluntárias portuguesas com um diferente diagnóstico para cancro da mama hereditário: dois portadores de VUS para o gene BRCA1 e dois controlos negativos. Neste estudo selecionámos quatro técnicas para avaliar a resposta celular a lesões induzidas por Doxorubicina: Ensaio de TUNEL, ensaio de atividade de Caspases, ensaio de H2Ax e ensaio do “cometa”. O ensaio de TUNEL é um método de deteção da fragmentação de DNA apoptótico in situ, que como é sugerido, identifica tanto células em apoptose, como lesões no DNA, quando usado isoladamente. O ensaio de atividade das Caspases permite a deteção de caspases ativas, ou seja, de proteases cisteínicas intracelulares e que desempenham papéis fundamentais na via da apoptose e inflamação. Desta forma, com este método, ao detetar caspases que estejam ativas estamos a detetar diferentes fases de apoptose das células. Em relação à metodologia de H2Ax, é um método que se baseia na análise de marcadores para quebras de dupla cadeia do DNA (DSBs). Estes marcadores internos, alteram a sua conformação quando o DNA sofre lesões e por esse motivo, ao quantificar esses marcadores alterados, é possível quantificar as células afetadas por determinado estímulo. Por último, o método do “cometa” possibilita a quantificação de células que sofreram dano no DNA por meio de análise da quantidade de DNA que migrou para fora do núcleo quando a mesma célula sofreu um determinado estímulo. É a esta migração de DNA que se dá o nome de cometa, visto apresentar uma aparência semelhante. Todas estas técnicas, com exceção do método do “cometa” que é analisada microscopicamente, são realizadas em citometria de fluxo, uma vez que se trata de uma metodologia altamente sensível para avaliação dos resultados. Os resultados obtidos provenientes do TUNEL e da atividade de Caspases tiveram algumas diferenças entre si, muito devido a variabilidade intra e inter-individual, o que torna essencial realizar novos ensaios. Relativamente ao ƴH2Ax e ao ensaio do cometa, os resultados para além de mostrarem as referidas variabilidades, intra e inter-individuais, também mostra um aumento de sensibilidade possivelmente associada com uma deficiência na reparação de DNA com o aumento de dose de Doxorubicina, para as amostras de portadores de VUS. De facto, exceto o TUNEL, todas as técnicas mostram essa sensibilidade quando as amostras são tratadas com o agente. No que toca aos controlos positivos (Camptotecina - CPT e Peróxido de Hidrogénio - H2O2), os resultados não são os mais esperados, contudo enquanto nos estudos de apoptose, o CPT mostra níveis de apoptose, mesmo que poucos, nos estudos de quantificação de lesão no DNA, a H2O2 mostrou danos elevados em apenas algumas amostras, levando a crer novamente a existência de variabilidade inter-individual neste estudo. Deste modo, em ensaios futuros é essencial testar a eficiência destes mesmos controlos para um melhor controlo e entendimento dos resultados obtidos. Para além disto tudo, estes resultados são o exemplo da grande limitação que o uso de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) oferecem a estudos deste género, visto que as colheitas intensivas de sangue por injeção são de certo modo, invasivas quer para os voluntários, limitando por uma questão ética a obtenção de células a serem usadas nos trabalhos. Desta forma, um dos nossos objetivos futuros é o estabelecimento de uma linha imortalizada de linfócitos B humanos que poderá ajudar a ultrapassar este problema. Contudo, enquanto as linhas não estão prontas e, em grande parte devido à existência de variabilidade genética, devem ser realizados mais ensaios e estudos, de forma a compreender melhor os resultados obtidos e para ser possível caracterizar as VUS mais frequentes em genes relacionados com cancro e nos dar algumas respostas sobre o risco de cancro da mama.Breast cancer is the second most commonly diagnosed cancer worldwide and the most common cancer among women. It is the family history or genetic predisposition the most important factor of breast cancer risk. In fact, 5-10% of cancer cases are hereditary breast cancer (HBC), and mainly of them are associated with inherited mutations in BRCA1 and BRCA2 genes. These genes are involved in both the main DNA DSB repair pathways - non-homologous end-joining (NHEJ) and, the most important, homologous recombination (HR). So, mutations in these genes could cause defectives in DNA repair, and because of that, cells that suffer serious unrepaired damage might triggers the development of breast cancer. To avoid that, it is very important to perform clinically a genetic testing, which could identify individuals and families with genetic predisposition to developing cancer, like mutations in BRCA1 and BRCA2. Unfortunately, in 12%-13% of the patients tested for BRCA1/2 mutations, are detected VUS, or variants of uncertain significance, which does not know if the variant is either benign or pathogenic, which generates significant problems in risk evaluation, counselling and preventive care. To overcome this problem, several functional assays have been or are being developed to clarify its mutational status. Our goal with this study is a functional evaluation of the role of VUS previously identified, in drug response (Doxorubicin). To doing so, we performed a proof of concept functional analysis using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) collected by venous puncture from four Portuguese volunteers: two VUS-carriers patients in the BRCA1 gene and two negative controls. In this study we selected 4 techniques to assess the cellular response to lesions induced by Doxorubicin: TUNEL assay, Caspases activity assay, H2Ax assay and Comet assay. The results from TUNEL assay and Caspases activity assay had some differences between each other, mainly due the existence of intra-individual variability, what makes essential to perform another’s assays. The results for ƴH2Ax and Comet assays besides showing intra- and inter-individual variabilities, showed an increase of sensitivity possibly associated with a defective in DNA repair for VUS-carriers, after exposure to increased doses of doxorubicin. In fact, except TUNEL assay, all techniques show this sensitivity when the samples were treated with Doxorubicin. However, and mainly because of the existence of genetic variability additional assays and studies should be performed to understand the results obtained and to possibly characterize the highly frequent VUS in cancer-related genes and give us some answers about breast cancer risk