Study of bacteria involved in Acacia longifolia nodulation: influence of fire on symbiosis establishment

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019As invasões biológicas são uma das maiores preocupações atuais no que diz respeito à biodiversidade local, uma vez que as espécies exóticas, para garantir a sua sobrevivência no novo habitat natural, acabam por superar as espécies nativas. Esta dicotomia nativas-exóticas deve ser abordada de forma dinâmica e pragmática, do ponto de vista de conservação das espécies, aliado ao facto do planeta estar em constante e rápida mudança. Quando invasoras, as espécies exóticas têm diversos efeitos no novo habitat que podem variar com o tempo e exponencialmente com as alterações climáticas; são consideradas uma das mais sérias ameaças à diversidade e funcionamento dos ecossistemas e são descritas como “animais ou plantas que são introduzido(a)s, acidental ou deliberadamente num habitat natural, no qual não são normalmente encontrad(o)as, acarretando graves consequências neste seu novo ambiente”. Acacia longifolia (Andrews) Willd. é um exemplo extremamente relevante de uma espécie exótica invasora, pertencendo à terceira maior família de angiospérmicas, as leguminosas (Fabaceae ou Leguminoseae) e apresentando uma distribuição global em diversos habitats desde as florestas tropicais às regiões áridas. A. longifolia é nativa dos sistemas dunares das zonas costeiras do sul da Austrália, tendo sido introduzida em Portugal para estabilização das dunas, combate à erosão e com fins ornamentais durante o final do século XIX e início do século XX; no entanto, tornou-se uma grande questão ecológica, tendo sido classificada como uma invasora generalizada com uma elevada plasticidade adaptativa, sendo inclusivamente descrita como “engenheira de ecossistemas”. Recentemente, esta espécie é classificada como uma das invasoras mais agressivas, não só em Portugal como na África do Sul, Califórnia e Brasil, devido ao facto de (1) reduzir a biodiversidade das comunidades locais devido ao desenvolvimento de uma copa densa e capacidade de se comportar como arbusto ou árvore, (2) impacto nos serviços dos ecossistemas devido à elevada utilização de recursos hídricos, (3) alterar a dinâmica dos ciclos de nutrientes nomeadamente através da fixação simbiótica de azoto e (4) alterar os regimes de fogos devido à excessiva acumulação de folhada. Em Portugal, em sistemas dunares, tem vindo a ser observado o impacto da A. longifolia desde a fase inicial do processo de invasão, no qual as espécies nativas demarcam a sua influência através do acréscimo de azoto. Nos climas mediterrânicos, como é o caso de Portugal, os fogos, que ocorrem frequentemente, promovem a germinação das sementes de A. longifolia, no entanto, o sucesso colonizador desta espécie é potenciado pela sua associação simbiótica com bactérias fixadoras de azoto que garantem o seu sucesso em ecossistemas com limitação de nutrientes e facilitam o desenvolvimento, sendo designadas como bactérias que promovem o desenvolvimento da planta. De facto, esta simbiose tem vindo a ser estudada como modelo, devido aos desafios que acarreta para as plantas, que necessitam de se habituar à presença das bactérias sem inviabilizar a sua sobrevivência e para as bactérias, cujo fitness é largamente incrementado. Concomitantemente, esta simbiose implica uma relação íntima entre ambas as partes, a fim de se desenvolver o mutualismo na sua forma funcional e crucial: a fixação do azoto, através da qual as plantas recebem o azoto sob a forma de amónia e as bactérias recebem carboidratos e proteção. Este processo de fixação de azoto decorre em estruturas diferenciadas nas raízes da planta, denominadas como nódulos. A nodulação é um processo complexo de troca de sinais e reconhecimento celular entre a planta (macrosimbionte) e as bactérias compatíveis (microsimbiontes), para que o processo de infeção e subsequente diferenciação em bacteróides ocorra e a fixação inicie. Os procariotas fixadores de azoto, também conhecidos como diazotróficos, são um grupo altamente diverso, tanto taxonómica como funcionalmente, incluindo bactérias de diversas classes: Alphaproteobacteria, onde se incluem os géneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium e Ensifer (anterior Sinorhizobium), Betaproteobacteria, que inclui o género Burkholderia (recentemente descrito como Paraburkholderia quando associado às plantas) e Actinobacteria como o género Frankia. A. longifolia estabelece simbiose, maioritariamente com os géneros de Alphaproteobacteria mencionados. Estes procariotas são comummente designados de rizóbios. Este estudo teve como principais objetivos (1) descrever o(a)s géneros/espécies bacteriano(a)s estão envolvido(a)s nesta simbiose, (2) analisar se o fogo influencia/altera a comunidade bacteriana que é estabelecida nos nódulos e (3) descrever o ambiente em que os nódulos se inserem, bem como, a sua caracterização morfológica. Nódulos de plantas jovens de A. longifolia (20-60 cm) foram recolhidos no campo em zonas não ardidas e ardidas (um ano após o fogo). Após aplicação de um protoloco de desinfeção, os nódulos foram macerados em pools de 1-4 nódulos e fez-se crescimentos em meio YMA; para estudos morfológicos e estruturais, foram feitas secções longitudinais e transversais para observação à lupa. O DNA bacteriano foi extraído das culturas puras obtidas e procedeu-se ao fingerprinting por amplificação por PCR com os primers universais M13 e GTG-5. A análise da diversidade teve por base a construção de dendrogramas utilizando o coeficiente de similaridade de Pearson e o método de aglutinação UPGMA. A amplificação do rRNA 16S, após análise de clusters, permitiu identificar géneros (e espécies) envolvidos nesta simbiose. Adicionalmente, aplicou-se, dum ponto de vista percursor e exploratório, a Sequenciação de Nova Geração através do sistema Nanopore para complementar os dados obtidos relativamente à diversidade bacteriana pela metodologia anterior. Paralelamente, a caracterização do solo e análises isotópicas das folhas e dos nódulos relativamente ao carbono e azoto foram feitas para compreender o ambiente exterior à simbiose e o microambiente do nódulo, respetivamente. Um total de 152 isolados foi obtido, 92 isolados a partir de nódulos da zona não ardida e 60 obtidos da zona ardida. Uma maior diversidade foi observada na zona não ardida comparativamente à zona ardida, no entanto, uma maior especificidade bacteriana, considerando a capacidade de fixar azoto, parece estar associada à zona ardida. Isto poderá indicar que o fogo tem influência no “bacterioma” do nódulo. Bradyrhizobium sp. foi o género mais representado (e dominante) em ambas as zonas, seguido dos géneros Paraburkholderia sp. e Pseudomonas sp. Estes resultados, obtidos através de fingerprinting e sequenciação da região 16S foram corroborados pelos dados obtidos por Sequenciação de Nova Geração, adicionando um outro género, Massilia sp., que também apresentou elevada representatividade na zona não ardida. A nível intraespecífico, verificou-se uma grande diversidade de espécies de Bradyrhizobium sp., representadas em ambas as zonas, destacando-se o Bradyrhizobium cytisi. Isto parece sugerir que decorre um processo de especialização simbiótica entre a A. longifolia e esta espécie, podendo ser este o fator-chave para garantir a fixação eficiente de azoto, desempenhando um papel facilitador. As análises isotópicas revelaram a ausência de fixação biológica de azoto, como indicaram os valores do δ15N dos nódulos; contrariamente, estes valores para as folhas corroboram a utilização de azoto obtido por fixação no desenvolvimento da planta. Isto parece evidenciar que a nodulação é um processo dinâmico e não permanente. A. longifolia é uma típica invasora, uma vez que tem a capacidade de se adaptar a diferentes condições como a seca, escassez de nutrientes e perturbações. O fogo parece ter influência na diversidade bacteriana encontrada dentro dos nódulos e na sua função de fixação de azoto. Após esta perturbação, A. longifolia parece preferenciar as bactérias fixadoras de azoto, podendo estas ser descritas como as “primeiras colonizadoras” aquando restabelecimento da simbiose, nas quais se incluem diferentes espécies de Bradyrhizobium sp. Um maior conhecimento desta relação simbiótica pode contribuir para a melhor gestão e controlo desta espécie exótica invasora.Acacia longifolia is an invasive leguminous species that can cause a considerable damage in the ecosystems. This species, native from coastal dunes of southern Australia, was brought to Portugal for dune stabilization, preserve sand erosion and ornamental purposes, competing with native plants for natural resources and changing the soil characteristics. The expansion of this species, in the last decades, caused an environmental impact, in particularly in the Portuguese coastal dunes. Several factors potentiate its expansion, namely fires that occur frequently and promote seed germination. Furthermore, high colonization success of A. longifolia is related to its association with nitrogen-fixing bacteria, that develop inside root nodules, where fixation occurs. These bacteria, belonging mainly to the Rhizobiaceae family are determinant in plants’ growth. Out study aimed to understand (1) which bacteria (genus/species) are present in the symbiosis; (2) if fire will alter the bacterial community established in the nodules; and (3) nodule morphological characterization. Nodules from 20-60 cm long young plants of A. longifolia were collected in the field in unburnt zone and burnt zone (one-year after fire). For bacterial isolation, disinfection protocol was applied in nodules and a total of 152 bacterial isolates were obtained in YMA growth medium. DNA was extracted and genomically fingerprinted by PCR amplification with M13 and GTG-5 universal primers. Assessment of diversity was based on dendrograms with Pearson similarity coefficient and UPGMA. The amplification for rRNA 16S gene was performed to identify the main bacterial genera involved in symbiosis. Next Generation Sequencing was achieved to complement bacterial diversity data for the first time in nodules. Alongside, soil characterization and isotopic analysis (N and C) were done to understand outside and inside nodule environments, respectively. A total of 152 isolates were obtained, 92 from unburnt zone and 60 from burnt zone. A higher bacterial diversity was observed in unburnt zone and high specific symbionts were found in burnt zone in what concerns nitrogen fixation. Bradyrhizobium sp. was the dominant genus in both zones, as well as, Paraburkholderia sp., Pseudomonas sp. and Massilia sp. Isotopic analysis revealed that nitrogen provided by fixation is being used by young plants regarding values of δ15N in leaves, however biological nitrogen fixation is not functioning regarding values from young plants nodules. Our study shows that, after fire, there seems to exist some bacteria as first settlers that are predominantly nitrogen-fixing bacteria; Bradyrhizobium sp. was revealed as an extremely important genus in this symbiosis