Influence of abiotic factors on growth and nodulation of Acacia longifolia

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019O género Acacia está entre os invasores mais agressivos em todo o mundo. Este grupo de plantas leguminosas causa sérios problemas nos habitats em que é introduzido, uma vez que modifica drasticamente as comunidades nativas, provoca alterações no solo, nomeadamente nos reservatórios de carbono e azoto, e ainda no ciclo da água. Uma vantagem competitiva importante da maioria das acácias em relação às plantas nativas resulta da possibilidade de crescer e prosperar em solos muito pobres, por terem a capacidade de desenvolver nódulos fixadores de azoto, que promovem a sua nutrição e desenvolvimento. Portanto, a introdução de Acacia diminui a diversidade biológica e altera o funcionamento dos ecossistemas. Em Portugal, uma das espécies mais problemática é a Acacia longifolia. Esta espécie foi introduzida no nosso país pelos serviços florestais como forma de preservar e fixar dunas de algumas zonas costeiras. Desde a sua introdução nos séculos XIX e XX, a espécie colonizou os ecossistemas agro-florestais e dunares, perturbando o seu funcionamento e alterando o equilíbrio nas comunidades de flora nativa. O potencial invasor e a capacidade de colonização desta espécie exótica deve-se, em parte, à sua capacidade de estabelecer relações simbióticas com bactérias fixadoras de azoto presentes no solo. A fixação de azoto ocorre dentro dos órgãos recém-formados nas raízes da planta, designados por nódulos, como resultado de uma simbiose estabelecida entre a planta e bactérias colectivamente designadas por rizóbio. Vários estudos têm sido realizados, relativamente ao processo de fixação biológica de azoto e no impacto que Acacia spp. tem sobre os habitats que invade, especialmente no solo e nas populações endémicas. No entanto, sabe-se pouco sobre a forma como os factores abióticos, por exemplo, as características do próprio solo, podem influenciar e condicionar o desenvolvimento das plantas. Neste trabalho temos como objectivo compreender como as condições abióticas podem potenciar ou limitar o desenvolvimento de A. longifolia. Nesse sentido pretendemos comparar o desenvolvimento de acácias germinadas em tipos três solos – agrícola, florestal e dunar, submetidas a diferentes condições de nutrição e irrigação. Pretende-se assim compreender, e como estes factores vão condicionar a formação de nódulos radiculares, bem como o estabelecimento de relações de simbiose entre a planta e microorganismos fixadores de azoto presentes no solo. Para tal, foram recolhidas amostras de sementes e solo da região de Vila Nova de Mil Fontes. As sementes foram germinadas e, posteriormente, desenvolvidas em estufa, em três tipos diferentes de solos - agrícola, florestal e dunar. Adicionalmente as plantas foram sujeitas à conjugação de quatro tratamentos – irrigação a 30% ou 70% da capacidade de campo, presença ou ausência de solução nutritiva. As plantas tiveram um período de crescimento de vinte semanas e ao fim desse período foram avaliadas, através da medição, em cada planta, dos seguintes parâmetros: (1) comprimento aéreo e radicular; (2) área total da folha; (3) número e peso fresco dos nódulos, filódios e raízes e (4) níveis relativos de clorofila, medidos com SPAD-502. Adicionalmente três discos de filódios foram removidos de algumas das plantas em estudo, não só de modo a avaliar o conteúdo absoluto de pigmentos fotossintéticos, como também numa tentativa de estabelecer uma curva de calibração com as leituras de SPAD. O processo de fixação de azoto foi avaliado tendo por base a composição isotópica de carbono e azoto, tanto nos nódulos, como nos filódios. Adicionalmente, as comunidades bacterianas presentes nos nódulos radiculares foram isoladas. Primeiramente, os nódulos de cada solo e respectivo tratamento foram agrupados e desinfectados. Após confirmação da sua desinfecção por impressão em caixa de Petri, os mesmos foram macerados e suspendidos em NaCl 0.85% . Posteriormente, esta suspensão foi inoculada em meio de manitol e incubada durante 48 a 72 horas. Por repicagens sucessivas, foram obtidas colónias puras, procedendo-se à lise das células, através do boiling method, seguido da análise molecular por fingerprinting. A análise foi realizada através da técnica de Rep-PCR, tendo sido testados três primers – M13, PH e GTG5. Os produtos obtidos por amplificação foram separados por electroforese em gel de agarose e as imagens resultantes foram capturadas com UV transiluminador Alliance 4.7 (Uvitec, Cambridge) e analisadas com o software BioNumerics, de forma a avaliar a diversidade bacteriana presente. A análise de dados realizada após levantamento do ensaio, revelou que o desenvolvimento dos exemplares de A. longifolia foi principalmente afectado pelo solo e pelo regime nutritivo. As acácias desenvolveram-se mais em solo florestal e agrícola, traduzindo pelo maior crescimento da parte aérea e pelo maior número de filódios. No entanto, as plantas desenvolvidas neste último tipo solo, apresentaram um menor número de nódulos. Em contraste, no solo dunar registou-se um menor desenvolvimento, particularmente em termos de crescimento, número e área dos filódios. Estas diferenças deveram-se principalmente às características do solo, regime nutritivo e à sua interacção. O solo agrícola foi um solo artificialmente alterado, sujeito a fertilização, com elevada disponibilidade nutritiva. O solo florestal teve uma elevada quantidade de matéria orgânica. O solo dunar apresentou uma composição intermédia, em termos de disponibilidade de matéria orgânica e de nutrientes. Logo, uma maior disponibilidade nutritiva levou por um lado a um maior desenvolvimento e por outro, a uma menor nodulação e fixação de azoto. De forma análoga, considerando o regime de solução nutritiva, os exemplares às quais esta foi adicionada tiveram um maior crescimento, resultante da maior disponibilidade de nutrientes, que tende a promover o desenvolvimento das plantas. Houve, tendencialmente, um maior incremento (aéreo e radicular) na presença de solução nutritiva e conforto hídrico (W+N+), particularmente nos solos florestal e agrícola. Em suma, a acção simultânea dos diferentes factores abióticos influenciou o desenvolvimento da planta. No entanto, a influência dos diferentes factores e conjugações de tratamentos foi diferente consoante o solo em que foram aplicados. As plantas que se desenvolveram em solo agrícola, por ser rico em nutrientes e com grande capacidade de retenção de água, foram de modo geral pouco afectadas por alterações nos tratamentos, enquanto que as que se desenvolveram em solo dunar (poroso e pobre em nutrientes), viram desenvolvimento condicionado pelos diferentes regimes de nutrição e irrigação. Os nossos resultados evidenciaram ainda que em situação de menor disponibilidade nutritiva houve uma maior fixação de azoto atmosférico, o que se traduziu em menor conteúdo δ15N. Esta tendência foi transversal aos vários tipos de solo, mas foi particularmente evidente no solo dunar, onde foram registados os valores mais baixos. Quanto às concentrações de pigmentos fotossintéticos, houve uma tendência para que fossem mais baixas em solo agrícola, resultantes de filódios com maior área e maior conteúdo hídrico. Quanto à análise da diversidade bacteriana, foram obtidos 111 colónias a partir dos nódulos radiculares. O fingerprinting obtido com os primers PH e GTG5 evidenciou não só a diversidade e heterogeneidade bacteriana associada a A. longifolia, como também o caracter generalista da espécie. No entanto não foi possível estabelecer qualquer correlação entre as colónias obtidas e as combinações de tratamentos aplicadas durante o ensaio experimental, o que indica que estes tratamentos não influenciaram o número de bactérias em simbiose com A. longifolia. Não foi também possível correlacionar o desenvolvimento das acácias com a diversidade bacteriana obtida em cada solo e respectivo tratamento. Estes resultados são, no entanto, preliminares, pelo que será necessária a realização de mais estudos que permitam a identificação das bactérias, e deste modo melhor compreender se há uma correlação entre o desenvolvimento da planta e as estirpes bacterianas presentes nos nódulos radiculares. Relativamente à calibração entre as leituras de SPAD e os níveis absolutos de pigmentos fotossintéticos, foram obtidos baixos coeficientes de ajustamento, entre 0.1 e 0.3, para os modelos calculados. Apesar destes valores, a relação entre as leituras espectrofotométricos e de SPAD-502, de clorofila e de carotenóides, foram estatisticamente significativa. Logo, as equações de calibração obtidas possuem capacidade preditiva, sendo, no entanto, necessário a análise de mais amostras para validar o modelo. Como conclusão deste trabalho, e considerando a Acacia longifolia uma espécie invasora extremamente agressiva que perturba e modifica habitats e comunidades tanto em Portugal como noutras regiões do mundo, o estudo dos factores que influenciam o desenvolvimento da espécie é essencial. Uma vez que o sucesso de A. longifolia resulta da conjugação e interacção de vários factores, serão necessários mais estudos que sigam uma perspectiva integrativa. Com este trabalho, pretendeu-se dar-se uma contribuição para o melhor entendimento dos processos subjacentes ao sucesso de A. longifolia como invasora, tais como o papel dos factores abióticos na modulação do desenvolvimento da planta e a importância da fixação biológica de azoto, particularmente em situações de escassez de nutrientes, de forma a encontrar estratégias para evitar o seu estabelecimento e controlar a sua dispersão.The genus Acacia is amongst the most aggressive invaders worldwide. This group of leguminous woody plants causes severe problems in habitats in which it is introduced since it drastically changes communities. In Portugal, Acacia spp. is one of the most prolific plant invaders, specifically the species Acacia longifolia, introduced in the country’s coastal areas in the late 19th century, early 20th century. Since their introduction, the species has colonized agroflorestal and dune ecosystems, disrupting their functioning, altering the balance in native flora community. One of the key functional traits of invasive potential and colonizing capacity of these alien species lies in their ability to perform biological atmospheric nitrogen fixation. The nitrogen fixation occurs inside of newly formed organs, the nodules, as a result of a symbiosis established between the plant and legume nodulating bacteria, the rhizobia. The process of biological nitrogen fixation and the impact that Acacia spp. have on the habitats it invades, specially concerning the soil and the above and belowground communities is well documented. However, not much is known about how the characteristics of the soil itself, as well as other abiotic factors, might affect plant development and its influence on the process underlying the species invasive ability. This study intends (1) to access how abiotic factors modulate A. longifolia development, using seedlings grown in three different types of soil – forest, agricultural and dune, and submitted to different conditions of irrigation and nutrition. We set out to evaluate the effect of these factors on overall plant development, and (2) to correlate also plant development with the plant capacity to nodulate. Furthermore, we intent (3) to better understand the symbiosis between nitrogen-fixing microorganisms, as well as, (4) to find the correlation between SPAD readings and photosynthetic pigments content, through the determination of the calibration equation. Seedlings of A. longifolia were germinated in the different types of soil (forest, agricultural and dune) under four treatments – hydric comfort vs hydric stress, in combination with presence vs absence of nutritive solution. After twenty weeks of growth, performance of the plants was evaluated by measuring (1) shoot and root length; (2) total leaf area; (3) number and fresh weight of nodules, phyllode and roots and (4) relative levels of chlorophyll through SPAD. Later, absolute photosynthetic pigments content was determined, while the nitrogen fixation process was evaluated based on the isotopic composition of carbon and nitrogen, both in nodules and phyllodes. The results demonstrate that specimens germinated in forest and agricultural soil grew more, but the ones in the latter had fewer nodules. In turn, A. longifolia seedlings developed in dune soil had a lower growth and a greater development of root nodules. Furthermore, a higher nutrient availability led to a greater plant development, accompanied by less nodulation and nitrogen fixation. Though, with the reduction of nutrient reinforcement, there was a greater fixation of atmospheric nitrogen, since phyllode δ15N values were closer to zero in the absence of nutrient solution. This trend, transversal to soil type, was particularly evident in the dune soil. Thus, our results indicate not only the preponderance of abiotic factors such as soil and nutrition in the promotion and hinder of growth and nodulation of Acacia longifolia, but also that this conditioning is a result of their interaction. Regarding the calibration between the SPAD readings and the absolute levels of photosynthetic pigments, despite the low adjustment coefficients, the calibration equations obtained had predictive capacity. However it’s necessary to analyse more samples to validate the model. Rhizobia analysis indicated not only, the varied and heterogeneous bacterial community associated with A. longifolia, but also the species status as a generalist. However, it was not possible to establish a correlation between the number and diversity of isolates and the treatments applied, since strains from the same soil and treatment combinations grouped into different clusters. Additional studies are necessary in order to identify the isolated bacteria and better understand the rhizobial community associated with A. longifolia and its influence on plant fitness.In conclusion, Acacia longifolia is an extremely aggressive invasive species that disturbs and modifies habitats and communities both in Portugal and in other regions of the world, rendering it essential the study of the factors that influence the development of the species