PLCE1 rs2274223 A}G polymorphism and its functional role in colorectal cancer

Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019Colorectal cancer (CRC) is one of the cancers with highest incidence and mortality in the world. In order to decrease these numbers earlier diagnosis, better treatments and better surveillance is required. In this context, cancer biomarkers arise as important tools useful for diagnosis, monitoring disease progression, predicting disease recurrence and therapeutic treatment efficacy. Therefore, it is necessary to find new CRC biomarkers highly sensitive and specific to help clinical decisions. In the last decade, Phospholipase C epsilon (PLCε) has been studied as a possible biomarker for CRC, particularly its single nucleotide polymorphism (SNP) rs2274223 has been associated with the risk of CRC development. In our study, we aimed, not only, to assess the risk of PLCE1 SNP rs2274223 in CRC development in a Portuguese population, but also, analyse how this polymorphism affected patient’s survival. Furthermore, we also investigated how this polymorphism influenced cellular processes such as proliferation, epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), angiogenesis and inflammation. Overall, our results show that PLCE1 SNP rs2274223 A>G is not associated with the risk of developing CRC. Furthermore, this polymorphism was not shown to be involved in CRC survival of stages I-III and IV patients. Moreover, we could not associate this phenotype with any abnormal cellular process. In sum, we found by several means that PLCE1 SNP rs2274223 A>G appears to have no role on CRC development and progression. Our findings are contrary to most of the published reports about this SNP.O cancro colorretal é o quarto cancro mais diagnosticado e o terceiro com maior mortalidade no mundo, sendo que em Portugal é o terceiro mais diagnosticado e o segundo com maior mortalidade. De forma a diminuir a mortalidade associada a esta doença é necessário diagnosticar a mesma em estadios iniciais, desenvolver melhores terapêuticas e ainda melhorar o acompanhamento da doença. É neste sentido, que os biomarcadores podem desempenhar um papel importante. Por essa razão, é necessário descobrir novos biomarcadores para cancro colorretal com maior sensibilidade e especificidade de forma a complementar e melhorar as decisões clínicas e terapêuticas para o doente. As fosfolipases C (PLCs) são potenciais biomarcadores que se encontram expressos em todas as células do organismo e que participam em variadas funções celulares como proliferação, motilidade, invasão e diferenciação. A principal função das PLCs é hidrolisar fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) existente na membrana celular dando origem a diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3). O IP3 é importante na regulação dos níveis de cálcio intracelular, enquanto que o DAG é capaz de ativar a proteína quinase C (PKC) e as suas vias a jusante. Existem 6 famílias de PLCs (PLCβ, PLCγ, PLCδ, PLCη, PLCζ e PLCε), todas elas partilham domínios catalíticos comuns, no entanto, também apresentam domínios, estruturas e mecanismos de regulação específicos. A PLCε tem expressão ubíqua em todos os tecidos, apesar da sua maior expressão se verificar no coração, pulmão e colon. Esta enzima apresenta domínios específicos como o domínio CDC25 na porção N-terminal e dois domínios de associação a RAS (RA1 e RA2) na porção C-terminal. O domínio CDC25 foi demonstrado como tendo função de troca de guaninas, portanto ativador da proteína RAP1, enquanto os domínios de associação ao RAS, em particular o domínio RA2, são importantes para a translocação da enzima do citoplasma para a membrana plasmática, onde exerce a sua função. Modelos animais transgénicos provaram que a depleção de PLCε pode levar ao desenvolvimento de hipertrofia cardíaca e ainda síndrome nefrótico. Esta enzima também já foi associada à inflamação da pele, à neuro-inflamação e ao cancro. No entanto, o papel desta PLC no cancro é controverso. Se por um lado foi documentado que em alguns cancros, como por exemplo do esófago, a PLCε exerce um papel oncogénico, noutros, como é o caso do cancro colorretal, a PLCε parece apresentar uma função supressora de tumor. Nos últimos anos, têm sido vários os estudos que associam a PLCε a cancro colorretal, em particular o seu polimorfismo rs2274223 tem sido associado com um risco aumentado de desenvolver esta doença. Este polimorfismo consiste na substituição de um nucleótido de adenina por uma guanina no gene PLCE1, que posteriormente se traduz na substituição de um aminoácido de histidina por um de arginina na posição 1927 da enzima, no seu domínio de ligação ao cálcio (C2). Este polimorfismo foi sobretudo associado a um aumento do risco de desenvolver cancro esofágico e gástrico. No entanto, em cancro colorretal, a sua função é controversa. Enquanto que foi possível associar este polimorfismo ao desenvolvimento de cancro colorretal na população chinesa e na população turca, o mesmo já não foi possível observar numa população lituana e letã. No nosso estudo propusemo-nos a verificar se existe alguma associação entre o polimorfismo rs2274223 do gene PLCE1 e o desenvolvimento de cancro colorretal, na população portuguesa. Para além disso, fomos ainda verificar, pela primeira vez, se este polimorfismo poderia ter algum impacto na sobrevida dos doentes com cancro colorretal em estadios I-III e em estadio IV. Após a genotipagem de 218 pacientes com cancro colorretal e 221 respetivos controlos (equiparados para idade e sexo), os nossos resultados mostram que este polimorfismo não se associa com um maior risco de desenvolver cancro colorretal em nenhuma das diferentes associações que testámos (AA vs. AG p=1, AA vs. GG p=0,66, AA vs. AG+GG p=0,85, GG vs. AG p=0,66 e GG vs. AA+AG p=0,68). Apesar de negativo, este resultado vem corroborar os resultados dos trabalhos desenvolvidos em populações do norte da europa (lituana e letã), os quais também não encontravam correlação deste polimorfismo com o desenvolvimento desta doença. Estes resultados podem ser explicados pelo facto de inicialmente este polimorfismo ser associado ao risco de desenvolver cancro gástrico e esofágico, podendo a PLCε apresentar um papel diferente em CRC. Além disso, a maioria dos estudos foi realizado na população chinesa, sendo que, existem estudos na população europeia que indicam que este polimorfismo não está associado com o risco de desenvolver CRC. Uma das explicações para esta disparidade de resultados em populações diferentes pode ser a existência de um menor Linkage Disequilibrium (LD) na população europeia. Desta forma, este polimorfismo não seria o responsável pela carcinogénese na população chinesa, mas sim a existência de outros polimorfismos com um alto LD. Resumindo, diferenças populacionais e de tipo de tumor podem, em parte, justificar a diferença dos nossos resultados com os anteriormente publicados. Posteriormente, verificámos que, este polimorfismo não influencia a sobrevida dos doentes com cancro colorretal nos estadios I-III (p=0,805) em analises uni- e multivariadas controlando para as características dos pacientes e do tumor que podem afetar o prognóstico da doença como a idade, estadio, grau de diferenciação, localização do tumor, obstrução e ou perfuração, invasão vascular, linfática e ou neural e a presença de margens cirúrgicas com tumor à altura do diagnóstico. Apesar de não existir uma correlação significativa com a sobrevida dos doentes diagnosticados em estadio IV após a análise multivariada controlando para a idade, a localização do tumor e o órgão onde se detetaram as metástases (p=0,089), os pacientes homozigóticos para o alelo G apresentam uma tendência negativa no seu tempo de vida. Uma vez que esta análise foi feita com apenas 6 pacientes homozigóticos para este alelo, seria importante aumentar este coorte de forma a obter um maior poder estatístico capaz de validar a tendência observada. É importante referir que na análise multivariada no estadio I-III e no estadio IV o braço GG apresenta poucos doentes, pelo que um maior número de doentes neste braço poderiam conferir um maior poder estatístico à análise multivariada. No entanto, fomos investigar in vitro os processos celulares relevantes para o desenvolvimento e progressão de cancro, com o objetivo de compreender melhor o papel deste polimorfismo. Existem estudos que associam a abolição da PLCε com um aumento da proliferação, com um aumento da libertação de fatores angiogénicos como VEGF-A e com um aumento de fatores pró-inflamatórios como COX-2, CXCL-1, CXCL-2, TNF-α, IL-1β, IL-6 e STAT3. No nosso estudo, para além de abordar a influência da sobre expressão das variantes de PLCε wild-type e PLCε mutante (H1927A) nestes processos, analisámos ainda de que forma este polimorfismo poderia afetar a atividade fosfolipídica da enzima e a transição epitélio-mesênquima (EMT) nas linhas de cancro colorretal HCT116 e DLD1. Da análise in vitro verificamos que em termos funcionais, a sobre expressão de PLCε wild-type e a sobre expressão da variante PLCε mutante (H1927A) não apresentam diferenças na atividade fosfolipídica da enzima. Contudo, a PLCε apresenta outros domínios funcionais específicos como o CDC25 e RA2, que poderão ser afetados por este SNP e que não foram testados neste trabalho. Relativamente à expressão dos fatores angiogénicos e pró-inflamatórios anteriormente mencionados, verificámos que não existem diferenças significativas quando comparamos o efeito da sobre expressão da PLCε wild-type e mutante (H1927A). Contudo, a sobre expressão da PLCε wild-type não se traduz numa diminuição generalizada dos fatores pró-inflamatórios como já foi publicado, com exceção para TNF-α, cuja expressão diminui nas linhas DLD1, e IL-6, que diminui nas linhas HCT116 após sobre expressão de ambas as variantes de PLCε. Fomos posteriormente verificar o efeito deste polimorfismo na proliferação celular. Assim, verificamos que a sobre expressão da PLCε (quer wild-type quer mutante H1927A) provoca uma diminuição na proliferação, sendo este resultado concordante com o papel supressor de tumor que é atribuído à PLCε neste tipo de tumor. No entanto, não existem diferenças na taxa de proliferação entre a sobre expressão da PLCε wild-type e da PLCε mutante (H1927A). Finalmente, não conseguimos observar diferenças significativas entre o papel da PLCε wild-type e da sua forma mutada (H1927A) na expressão de marcadores como a E-caderina, N-caderina, Vimentina e Twist importantes no processo de EMT. Em suma, o polimorfismo rs2274223 A>G do gene PLCE1 não parece apresentar qualquer influência em CRC, uma vez que não verificámos qualquer associação entre o mesmo e o risco de desenvolver a doença, a sobrevivência dos pacientes e nenhuma das funções celulares por nós testadas (atividade fosfolipídica, proliferação, EMT, inflamação e angiogénese)