Evolution and adaptation of Streptococcus pneumoniae population in the era of expanded conjugate vaccines

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Streptococcus pneumoniae (or pneumococcus) is one of the most important causes of bacterial infections mainly in young children, immunocompromised individuals of all ages and the elderly. It is responsible for meningitis, bacteremia and pneumonia, as well as sinusitis and otitis media. Besides this, the natural way of living of this bacterium is through asymptomatic nasopharyngeal colonization. Colonization rates are generally high among young children, the major reservoir and source of transmission of pneumococci. Once colonization is the first step for pneumococcal disease and is essential for bacteria spreading between individuals, this has been an important focus of research. Most pneumococcus have a polysaccharide capsule that is responsible for the existence of close to 100 variants (or serotypes) and that is considered its main virulence factor. For this reason, the capsule has been the main target for pneumococcal vaccine design. In Portugal, pneumococcal conjugate vaccines (PCVs) were only introduced in the Nacional Immunization Program in 2015. In the era of multivalent pneumococcal conjugated vaccines, epidemiological and surveillance studies are of major importance to obtain information that will help our understanding of serotype and clonal replacement changes occurring in carriage and disease as a consequence of vaccination. To obtain this information, microbial typing tools are fundamental to provide data about the evolution of bacterial population. Serotyping tools are widely used to address the effectiveness of pneumococcal vaccination. However, it is known that capsular type alone may not give the full picture regarding vaccine impact. The aim of this study was to address the clonal evolution and adaptation of the pneumococcus after the introduction of the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV13) in Portugal. For that, we used multilocus sequence typing (MLST), the ‘gold standard’ of molecular typing for the pneumococcus. We analyzed close to 700 nasopharyngeal isolates from children attending day-care centers, collected before introduction of PCV13 (2009 – 2010) and in the years afterwards (2011 – 2016) in two regions of Portugal. Our focus turned into answering main questions regarding the clonal evolution leading to persistence of some vaccine-types and emergence of non-vaccine types, overtime. The results showed that, regarding the few vaccine-types that are still in circulation, for most cases it is one major clone, that was already in circulation before vaccine introduction, that is responsible for the persistence of that serotype, as it is the case of the clonal complex (CC) 179 associated with serotype 19F. Besides that, whenever there is high clonal diversity and the presence of antimicrobial resistant clones before vaccine introduction, in most cases it is the resistant clone that is maintained overtime. Regarding non-vaccine types we detected clonal expansion associated with clones that were already in circulation and the emergence of novel, previously undetected clones. In this group of serotypes, antimicrobial resistance did not have such an important role as the one detected for the vaccine-type clones. We found few capsular switch events, but we could not correlate this phenomenon with vaccine impact. With this study we could conclude that PCV13 impacts on the pneumococcal population beyond capsular type and that this population is able to genetically adapt and evolve to this pressure.Streptococcus pneumoniae (ou pneumococos) é uma das principais causas de infeções bacterianas, principalmente em crianças, indivíduos imunocomprometidos de todas as idades e idosos. É um agente causativo de meningite, bacteriemia e pneumonia, assim como sinusite e otite. Apesar disto, o estilo de vida natural desta bactéria é através da colonização assintomática da nasofaringe. As taxas de colonização são geralmente elevadas em crianças, os principais reservatórios e fontes de transmissão de pneumococos. Uma vez que a colonização precede sempre a infeção e é essencial para a transmissão entre indivíduos, esta tem sido um foco importante de investigação. A maior parte das estirpes de pneumococos contêm uma cápsula polissacarídea que é responsável pela existência de cerca de 100 variantes (ou serotipos) e que é considerada o seu principal fator de virulência. Por esta razão, a cápsula tem sido utilizada no desenvolvimento de vacinas pneumocócicas. Em Portugal, a vacina pneumocócica polissacarídea conjugada apenas foi introduzida no Plano Nacional de Vacinação em 2015. Na presente época, em que estão disponíveis vacinas multivalentes, os estudos epidemiológicos e de vigilância são de enorme importância de forma a alcançar toda a informação que ajudará a perceber particularidades como a substituição de serotipos e clones que ocorre em colonização e em infeção como consequência da vacinação. De forma a obter esta informação, ferramentas de tipagem microbiana são fundamentais para fornecer dados acerca da evolução populacional bacteriana. Métodos de tipagem capsular são frequentemente utilizados para testar a eficácia da vacina pneumocócica. No entanto, a cápsula pode não fornecer toda a informação relativamente ao impacto da vacina. O principal objetivo deste estudo foi verificar a evolução e adaptação clonal do pneumococo após a introdução da vacina pneumocócica conjugada 13-valente (PCV13) em Portugal. Para isso, utilizámos a técnica ‘multilocus sequence typing’ (MLST), que é atualmente o padrão para tipagem molecular de pneumococos. Analisámos cerca de 700 isolados da nasofaringe recolhidas de crianças que frequentam infantários antes da introdução da PCV13 (2009 – 2010) e nos anos seguintes (2011 – 2016) em duas regiões de Portugal. Após análise dos dados, o nosso objetivo foi responder a algumas questões relacionadas com a evolução clonal que permitiu a persistência de alguns serotipos vacinais e a emergência dos serotipos não vacinais, ao longo do tempo. Os nossos resultados mostram que, relativamente aos poucos serotipos vacinais que ainda estão em circulação, na maioria dos casos é um clone principal, que já estava em circulação antes da introdução da vacina, que é responsável pela persistência dos serotipos, como é o caso do complexo clonal (CC) 179 associado ao serotipo 19F. Para além disto, quando há grande diversidade clonal e a presença de clones resistentes a agentes antimicrobianos antes da introdução da vacina, na maioria dos casos é o clone resistente que é mantido ao longo do tempo. Relativamente aos serotipos não vacinais detetámos expansão clonal associada a clones que já estavam em circulação e emergência de novos clones que não tinham ainda sido detetados. Neste grupo de serotipos, a resistências a agentes antimicrobianos não mostrou ser tão importante como nos clones associados a serotipos vacinais. Também detetámos alguns eventos de alteração da cápsula, no entanto, não conseguimos correlacioná-los com o impacto da vacina. Com este estudo podemos concluir que a vacina tem um impacto na população de pneumococos que vai para além do serotipo, e que esta população é capaz de se adaptar e evoluir geneticamente em resposta a esta pressão