DNA metabarcoding in terrestrial biodiversity assessment and monitoring: the case of nocturnal insects in NE Portugal

Tese de mestrado, Ecologia e Gestão Ambiental, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Biodiversity is declining worldwide, and one of its main causes is the expansion and intensification of agriculture. This process has been studied mainly for vertebrates and a few invertebrate groups, but information is missing for most insects despite their deep relationship with agriculture. This is partly due to difficulties in species identification, which requires taxonomic expertise and is costly and time consuming, especially for highly diverse insect communities. In traditional species identification, external or internal morphological characters are used to distinguish between different biological entities, one specimen at a time. Moreover, for many insect species only adult males (or females) can be reliably identified, and identification of larval stages or specimens in poor condition is often not possible. Recently, the development of next generation sequencing (NGS) of DNA is revolutionizing the ability to study highly diverse biological communities, by providing a relatively simple and inexpensive method for species identification. However, this approach remains little used in biodiversity assessment and monitoring, particularly in the case of nocturnal insects. Here we develop and test a workflow based on DNA metabarcoding for understanding how agricultural land uses affect the diversity and composition of nocturnal insect communities. Samples were collected in a complex mosaic landscape in NE Portugal in July (70 sites) and September (78) 2017 using UV light traps, covering four habitats with decreasing level of human management and increasing vegetation cover: vineyards, olive groves, cork oak woodland and riparian zones. Each site yielded a bulk sample of insects, which was processed using standard molecular and bioinformatics pipelines to produce a list of taxa identified at the lowest possible taxonomic level. Molecular procedures involved the testing of four metabarcoding primers, one of which produced the best results and was used in subsequent metabarcoding amplification. Validation of the method involving 12 samples revealed a close matching, albeit not perfect, between the species of moth (Lepidoptera) visually identified by a taxonomist and those recovered through metabarcoding. Metabarcoding of the bulk samples retrieved 1130 taxa, most of which were Lepidoptera (429 OTUs), Diptera (244) and Coleoptera (166). Despite this large number of taxa, accumulation curves revealed that sampling effort was still insufficient to capture the entire diversity within each habitat. There was significant variation in richness among habitats and between seasons, with vineyards showing consistently the lowest number of taxa. In contrast, the richness of olive groves was comparable, or even higher than that of the more natural cork oak and riparian habitats. The assemblage composition varied markedly across seasons, while variation among habitats was less marked, though there were differences in both characteristic and exclusive species. Variation in moth assemblage composition among habitats and seasons was related to functional traits, with for instance larger species recorded in cork oak and riparian habitats and in September, species with specialized diets in cork oak and September, and detritivore species in September. Overall, this workflow provides an efficient tool to assess and monitor nocturnal insects, with the potential for greatly advancing our understanding of agricultural impacts on biodiversity.A disrupção de sistemas naturais está associada à perda de biodiversidade e actualmente põe em risco o equílibro de toda a biosfera. Apesar do desenvolvimento e implementação de medidas de protecção de biodiversidade, muitas espécies continuam em perigo. Devido maioritariamente à acção humana as ameaças à diversidade natural são inúmeras, potenciando a perda de espécies ainda desconhecidas, uma vez que grande parte da diversidade biológica continua por descrever ou descobrir. Desta forma, evidencia-se a necessidade de conhecer e monitorizar esta diversidade às escalas local e global. Só é possível desenvolver ações de conservação adequadas e medir o sucesso das mesmas ao encontrar formas de conhecer e quantificar a diversidade e de a monitorizar ao longo do tempo e do espaço. Neste contexto, são os insectos e outros invertebrados que mais carecem de estudo, monitorização e acções de conservação. Com milhões de espécies desconhecidas que interagem em sistemas complexos, o estudo das comunidades de insectos torna-se desafiante. Ainda assim, os poucos estudos existentes indicam que, à semelhança do que ocorre com os vertebrados, muitas espécies de insectos estão em declínio. No entanto, sabe-se que os insectos desempenham um papel essencial nos ecossistemas, sendo responsáveis por diversos serviços e desserviços, nomeadamente em ecossistemas agroflorestais. Por um lado, participam em processos essenciais como a polinização e reciclagem de nutrientes, e por outro lado, constituem potenciais pragas capazes de causar graves danos à produtividade e economia agrícola. Neste contexto, estudar insectos é particularmente relevante e um dos desafios tem sido a identificação das espécies. Esta constitui uma das componentes inerentes a estudos de biologia e ecologia, bem como ao desenvolvimento de planos de monitorização eficientes. Tradicionalmente, a identificação de espécies de insetos tem sido feita com base em características morfológicas externas ou internas, um espécime de cada vez. Contudo, este processo depende do trabalho de taxonomistas especializados, tornando-se dispendioso em termos de custo e tempo. Mais ainda, a maioria das espécies sofre metamorfose completa e muitos organismos são virtualmente impossíveis de identificar nas fases larvares, o que dificulta o processo. Hoje em dia, existem novos métodos moleculares que cada vez mais permitem ultrapassar alguns destes problemas. Entre estes, salientam-se os métodos que surgiram com o desenvolvimento de sequenciadores de nova geração (NGS), nomeadamente um conjunto de técnicas designado DNA metabarcoding. O DNA metabarcoding faz uso de primers universais na amplificação de barcodes em massa, provenientes de espécimes contidos em várias amostras complexas. Estas amostras são posteriormente marcadas com curtas sequências distintas, o que permite juntar (pooling) e sequenciar múltiplas amostras e posteriormente recuperar a sua composição individual. O uso desta metodologia tem cada vez mais vindo a ser reconhecido como particularmente útil em amostras cujo estado não permite identificação, como água ou guano, ou em amostras complexas compostas por misturas de espécies. Contudo tem ainda muitas limitações associadas, entre as quais a falta de protocolos standardizados, a necessidade de desenhar primers universais, a morosidade dos processos dos quais dependem a construção de bibliotecas de barcodes e algumas limitações bioinformáticas. Ainda assim, o método tem potencial de produzir resultados com elevada resolução taxonómica, permitindo identificar múltiplas espécies de uma só vez, sem a dependência de taxonomistas experientes. Neste estudo utilizamos o DNA metabarcoding para estimar a diversidade de artrópodes terrestres num parque natural recentemente designado, o Parque Natural e Regional do Vale do Tua (PNRVT). O parque natural, está inserido numa paisagem fortemente fragmentada que resulta num complexo mosaico agroflorestal, típico do Mediterrâneo. No total, foram recolhidas 144 amostras de insectos no PNRVT em dois períodos distintos, Julho (n=68) e Setembro (n=76). A amostragem ocorreu numa área geográfica vasta, que se estende por todo o parque natural, em 2 habitats agrícolas e 2 habitats semi-naturais/naturais representativos da paisagem agroflorestal fragmentada que lhe é característica. Os tipos de habitat foram definidos por ordem crescente de cobertura vegetal e decrescente de intervenção humana: vinhas, olivais, sobreirais e galerias ripícolas. Nas amostragens utilizaram-se armadilhas de luz ultravioleta (UV), e o conteúdo de cada armadilha foi processado separadamente em laboratório até ao pooling das amostras para a sequenciação. Especial atenção foi dada aos lepidópteros que são um grupo de insectos altamente diverso e pouco estudado. Para colmatar a falta de informação centralizada sobre muitos aspectos da sua biologia foram compilados um conjunto de traits de espécies desta ordem recorrendo a várias fontes online. Nomeadamente, compilaram-se traits morfológicos, fisiológicos, comportamentais e de distribuição geográfica. Estes dados foram utilizados para completar as análises do ponto de vista ecológico. Desenvolveu-se e utilizou-se um protocolo dividido em 4 fases para analisar os dados obtidos através da sequenciação Miseq i) teste piloto, e da sequenciação Hiseq ii) validação do método, iii) design para a monitorização ecológica e iv) análise de traits. Inicialmente utilizaram-se apenas 3 amostras para um teste piloto que incluiu testar a eficácia de vários primers. Todas as amostras foram sequenciadas posteriormente com o primer que produziu melhores resultados, o BF2/BR2. Este par de primers permitiu produzir mais identificações ao nível da espécie e menos sequências únicas, com menos erros e reduzindo o tempo de análise. A validação do método i.e. comparação dos resultados obtidos com metabarcoding e identificação visual permitiu verificar que a maioria das espécies de lepidópteros foi detectada. A sequenciação das restantes amostras recolhidas foi levada a cabo na mesma corrida (Hiseq). Estas foram recolhidas segundo o desenho de um plano de monitorização que incluiu a montagem e recolha de um número considerável de amostras nos 4 habitats representativos da paisagem, fornecendo dados para várias análises de riqueza e composição de espécies. As restantes análises foram efectuada para todas as unidades taxonómicas operacionais (OTUs) com excepção da última, a análise de traits, que se focou apenas nos lepidópteros, dada a sua importância ecológica e também pela disponibilidade de informação. Apesar de terem sido recolhidas 144 amostras, o esforço de amostragem provou-se insuficiente para atingir um número de espécies representativo da riqueza actual. Ainda assim, e apesar de não ser possível obter informação relativa à abundância das espécies, o método permitiu obter resultados com bastante resolução taxonómica. Deste modo foi possível captar as diferenças na riqueza e composição de espécies entre épocas e habitats através de análises exploratórias e testes de significância estatística. Verificou-se que as vinhas tendem a apresentar os valores de riqueza média mais baixos, em conjunto com os sobreirais em Julho. Por outro lado, nos olivais ocorreram alguns dos valores mais elevados riqueza de OTUs, bem como nos sobreirais em Setembro. As maiores diferenças entre a riqueza global de insectos e de lepidópteros registaram-se nas galerias ripícolas, indicando que este habitat é muito rico em outros taxa de insectos. Pelo contrário, em zonas de sobreiral destacou-se uma elevada riqueza em lepidópteros, especialmente em Setembro. Ao nível da composição das comunidades, as diferenças captadas parecem estar maioritariamente relacionadas com a época de recolha das amostras como seria expectável, dado que a maioria das espécies de insectos só está em fase adulta e activa numa determinhada época do ano. Contudo as análises indicam que o habitat também tem influência na composição das comunidades. As galerias ripícolas foram o habitat mais distinto em Julho enquanto que em Setembro os sobreirais tinham uma composição mais única de OTUs. A maioria das análises aponta para maiores semelhanças na composição das comunidades presentes em olivais e vinhas, quer ao nível geral de composição das amostras quer por partilharem algumas espécies dominantes. Foi possível relacionar certos traits das espécies de lepidópteros com a sua ocorrência na paisagem e nas duas épocas de amostragem. Nomeadamente, registou-se a presença de espécies de maiores dimensões em sobreirais e galerias ripícolas, a ocorrência de espécies de menores dimensões, com menor número de gerações e tendencialmente polífagas no mês de Julho e de espécies detrítivoras em Setembro. Ainda é difícil explicar muitos destes padrões e perceber o seu significado ecológico uma vez que a biologia destas espécies é pouco conhecida. Simultaneamente, são muitas espécies para avaliar e conhecer, pelo que o seu estudo além de necessário e desafiante, abre as portas a uma série de questões científicas que permanecem por responder. Conclui-se que o DNA metabarcoding tem potencial para integrar estudos ecológicos e como ferramenta para monitorização rápida e eficaz, reproduzível no tempo e no espaco, para identificação de espécies em amostras complexas de insectos. Aqui demonstramos que esta ferramenta pode ser particularmente útil em contextos de comparação de habitats em vastas zonas fragmentadas num curto período temporal, mas que pode também ser extensível com resultados reproduzíveis e comparáveis ao longo do tempo. A elevada resolução taxonómica do método permitiu detectar diferenças entre riqueza e composição de espécies em cada habitat. Nomeadamente, o método permitiu identificar espécies dominantes, e até relaccionar a ocorrência de certas espécies com os seus traits morfológicos, fisiológicos e comportamentais. Além disso, a estrutura de análise em 4 fases pode ser utilizada noutros contextos com as devidas adaptações. Na verdade, as várias fases do processo incluem testes e validações e servem para auto-calibrar e adaptar o método, tornando a sua aplicação possível em diversos contextos e paisagens. Ainda assim, várias limitações inerentes método mantêm-se, quer anível laboratorial, quer bioinformático, e por isso é necessário continuar a investigar o seu uso e promover a sua implementação como uma prática corrente em estudos ecológicos