Recombinant antimicrobial polypeptides as alternative antibacterial agents

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Devido ao rápido desenvolvimento de bactérias resistentes a múltiplos antibióticos, tem havido um grande esforço no sentido de serem formuladas novas classes de moléculas que constituam uma alternativa viável aos antibióticos convencionais. Os péptidos antimicrobianos (AMPs) e as endolisinas têm sido propostos como sendo duas das alternativas mais promissoras. No entanto, a aplicação destes agentes em contexto terapêutico tem demonstrado algumas limitações que podem prejudicar a sua eficácia antimicrobiana. Os AMPs são pequenos péptidos sintetizados pela grande maioria dos seres vivos, fazendo parte dos mecanismos de defesa antimicrobiana. O seu modo de ação envolve a perturbação do invólucro celular bacteriano, levando frequentemente à dissipação da força proto-motriz (PMF). Por sua vez, as endolisinas são enzimas codificadas por vírus que infetam bactérias, os bacteriófagos ou fagos. São enzimas que degradam o peptidoglicano, um componente polimérico essencial na estrutura da parede celular bacteriana. As enzimas produzidas de modo recombinante conseguem degradar a parede celular, causando bacteriólise, capacidade esta que confere às proteínas o seu caracter antibacteriano (de enzibiótico). Contudo, foi demonstrado que bactérias Gram-positivas em crescimento ativo em meios complexos podem apresentar tolerância à ação bacteriolítica das endolisinas. Os mecanismos responsáveis por esta tolerância ainda não foram elucidados; no entanto, parecem depender de uma PMF intacta. Com base nestas observações, surgiu a ideia de utilizar a ação perturbadora dos AMPs sobre a PMF para potenciar a atividade bacteriolítica das endolisinas. Deste modo, selecionaram-se AMPs para fundir a uma endolisina que tem como alvo Bacillus subtilis, uma bactéria modelo Gram-positiva. Para um dos AMPs selecionados, verificou-se que a sua fusão à endolisina resultou num aumento drástico da atividade bacteriolítica em condições ótimas de crescimento bacteriano. Todavia, este efeito só foi observado quando as proteínas atuavam numa concentração mínima de 1 micromolar. Do mesmo modo, a atividade bactericida de uma das fusões apresentou um aumento de cerca de 3 ordens de magnitude quando comparada com a endolisina nativa. Globalmente, os resultados suportam a criação de uma nova classe de agentes antibacterianos contra bactérias Gram-positivas, designada AMPLys, que resulta da fusão de AMPs com ação perturbadora da membrana e de endolisinas que degradam a parede celular bacteriana.Due to the rapid development of drug resistant bacteria, there has been an effort in the search of new classes of molecules that may substitute or complement conventional antibiotics. Antimicrobial peptides (AMPs) and endolysins have been proposed and explored as two of the most promising alternatives. However, the application of these molecules, per se, in a therapeutic context has revealed some limitations that may hinder the antibacterial efficacy of the agents. AMPs are short peptides synthetized by most living organisms as part of antimicrobial defense mechanisms. Their antibacterial mode of action involves perturbation of the bacterial cell envelope, frequently with disruption of the so-called membrane proton-motive force (PMF). On the other hand, endolysins are enzymes encoded by the viruses that infect bacteria, the bacteriophages or phages. These enzymes degrade the peptidoglycan, an essential polymeric component of the bacterial cell wall. The capacity of recombinantly-produced endolysins to degrade the cell wall and cause bacteriolysis is what confers their antibacterial character (enzybiotics). However, it has been shown that, when actively growing in complex media, Gram-positive bacteria may present some tolerance against the lytic action of endolysins. The mechanisms responsible for this tolerance remain unknown, but they seem to depend on an intact PMF. Based on these observations, we have hypothesized that the PMF disturbing character of AMPs could be used to potentiate the bacteriolytic activity of endolysins. To test this idea, selected AMPs were fused to an endolysin targeting Bacillus subtilis, a model Gram-positive bacterial species. For one of the AMPs it could be shown that its fusion to the endolysin resulted in a dramatic increase of the bacteriolytic activity under optimal bacterial growth conditions. This effect required though that the fusion proteins acted at the minimum concentration of 1 micromolar. Likewise, the bactericidal activity of one of the fusion proteins showed an increase of 3 orders of magnitude when compared to the unmodified endolysin. Overall, our results point towards the generation of a promising new class of antibacterial agents towards Gram-positive bacteria, named AMPLys, which results from combining the membrane disturbing action of AMPs and the cell wall degrading activity of endolysins in a single agent