Investigation of MAT2A dependency in Acute Myeloid Leukaemia: a preliminary study in Acute Myeloid Leukaemia cell line

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Acute Myeloid Leukemia (AML) is a disease of dismal prognosis, with a 5-year survival of under 40% that has remained unmodified for the last 3 decades. Sequencing analyses of patient samples have identified recurrent mutations and highlighted associated common disease mechanisms, which have putative therapeutic value. Additionally, loss-of-function genetic or expression knockdown screens can be used to identify individual factors required for disease maintenance that may not be targeted by mutation. A recent drop-out screen based on Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats with the Cas9 endonuclease technology (CRISPR/Cas9) identified MAT2A (methionine adenosyltransferase2A) as a susceptibility gene in at least some forms of AML. In the work reported in this thesis, I aimed to validate the results of the screen by confirming dependency of cultured AML cells on MAT2A expression. I selected AML cell lines representing distinct common subtypes of human leukaemia, and evaluated the effects of knocking-out MAT2A through CRISPR/Cas9 gene editing technology. As a complementary strategy, I developed and validated RNA interference (RNAi) tools for MAT2A expression knockdown, which are also amenable for testing in AML patient samples. I observed that MAT2A loss resulted in reduced proliferation and survival of cultured AML cells. These results are currently being pursued mechanistically with a view to establishing novel therapeutic strategies in AML.A Leucemia mieloide aguda (LMA) é uma doença com um prognóstico bastante reservado, na qual menos de 40% dos doentes sobrevivem até 5 anos após diagnóstico da doença, sendo que esta percentagem permaneceu inalterada desde as últimas 3 décadas. As análises de sequenciação de amostras de pacientes identificaram mutações recorrentes e destacaram mecanismos associados, que têm valor terapêutico putativo. Além disso, fazer um screen para avaliar perdas de função genética ou mesmo knockdown de expressão de genes, pode ser útil na medida em que certos fatores individuais podem ser necessários para a manutenção da doença sem que estes sejam alvo de mutação. Um recente drop-out screen, que tem como base ir avaliando as consequências da perda individual de todos os fatores, baseada na tecnologia CRISPR, que consiste em pequenas porções do DNA bacteriano compostas por repetições de nucleotídeos, associada à endonuclease Cas9 (CRISPR/Cas9) identificaram o gene MAT2A (metionina adenosiltransferase2A) como um gene susceptível em pelo menos algumas formas de LMA. No trabalho exposto nesta tese, pretendi validar os resultados desse screen, confirmando a dependência das células com LMA cultivadas sobre a expressão de MAT2A. Selecionei linhas celulares com LMA que representavam subtipos comuns distintos de leucemia humana e avaliei os efeitos do knockout de MAT2A através da tecnologia de edição de genes CRISPR / Cas9. Como uma estratégia complementar, desenvolvi e legitimei ferramentas de RNA interferência (RNAi) para o knockdown de expressão de MAT2A, que também pode ser testado em amostras de pacientes com LMA. Observei que a perda de MAT2A resultou numa diminuição da proliferação e da sobrevivência nas células cultivadas com LMA. Estes resultados estão atualmente a ser seguidos mecanicamente com vista a estabelecer novas estratégias terapêuticas em LM