Molecular cytogenetic characterization of murine cell line SEWA

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017A hereditariedade e as alterações estruturais dos cromossomas são dois temas ligados à Citogenética Clínica que apresentam maior impacto aquando da tomada de decisão relativa a diagnósticos tumorais e pré/pós natais. Através de métodos de hibridação de fluorescência in situ, desenvolvidos ao longo dos anos, é possível obter informações relativas a alterações estruturais e variações numéricas no cariótipo celular, permitindo retirar conclusões relativamente à origem e prognóstico de cancros, e à viabilidade de fetos quando uma determinada doença congénita está presente numa família. Para que estes estudos sejam passiveis de ser realizados são necessárias linhas celulares modificadas. A linha celular SEWA é uma das mais usadas a nível de estudos carcinogénicos. Desenvolvida inicialmente a partir de um sarcoma osteogénico induzido por um polioma-vírus, o seu material carcinogénico foi posteriormente transformado em tumor ascítico e transplantado para ratinhos da linhagem A.SW. A sua importância para os estudos sobre tumores prende-se no facto de esta linha celular ser caracterizada pela presença in vivo de cromossomas double minute, de cromossomas C-bandless e homogeneously staining regions. Estas estruturas cromossómicas contêm o oncogene c-myc, cujo grau de amplificação está diretamente correlacionado com a gravidade do tumor. No entanto, até à data, nenhuma caracterização do seu cariótipo foi publicada. Este trabalho visa apresentar um possível cariótipo para esta linha celular, com uma descrição detalhada das suas alterações estruturais e numéricas. Para tal, técnicas como MCB, SKY e aCGH foram usadas. Qualquer uma destas técnicas é derivada de uma tecnologia desenvolvida no final dos anos 60, denominada de hibridização de fluorescência in situ (FISH). Neste tipo de métodos, diferentes sondas são marcadas com diferentes marcadores fluorescentes de modo a que seja possível visualizar regiões específicas do genoma. Os resultados, obtidos através de processamento de imagem, seriam posteriormente usados para encontrar homólogos no genoma humano e associar essas alterações a um tumor humano. A presença de cromotripsis, estruturas comuns em tumores agressivos, que ocorrem nas etapas iniciais de carcinogénese, seria também indício de mau prognóstico na sobrevivência ao cancro. Estudos como este permitem que modelos de origem tumoral sejam desenvolvidos, possibilitando um prognóstico mais prematuro relativamente ao desenvolvimento e cura de determinados tumores. Neste trabalho, 30 metafases foram analisadas, tanto para o método SKY, como para o MCB, sendo que no último a análise foi realizada cromossoma a cromossoma. No entanto, devido à má qualidade dos resultados obtidos e a alguma inexperiência do operador, não foi possível retirar conclusões concretas relativamente às alterações cromossómicas encontradas. Apenas se concluiu que as células SEWA apresentam um cariótipo instável, com diferentes alterações entre metafases. Além disso, resultados entre métodos não coincidiram o que levou à impossibilidade de criar um cariótipo representativo da população celular analisada, nem à descrição de breakpoints, que teriam significado para determinar uma futura homologia com o genoma humano. Será então necessária uma reavaliação dos resultados para que novas conclusões sejam obtidas.Inheritance and structural changes of chromosomes are two themes related to Clinical Cytogenetics that present greater impact when making decisions regarding tumor and pre and post-natal diagnoses. Through in situ hybridization methods developed over the years, it is possible to obtain information on structural changes and numerical variations in the cellular karyotype, allowing investigators to draw conclusions regarding the origin and prognosis of cancers, and the viability of fetuses when certain congenital diseases are present in a family. The SEWA cell line, initially developed from osteogenic sarcoma induced by a polyoma virus, is one of the most widely used in carcinogenic studies. However, to date, no characterization of its karyotype has been published. This work aims to present a possible karyotype of this cell line, with a detailed description of its structural and numerical changes. For such, techniques like MCB, SKY and aCGH were used. The results would then be used to find homologs in the human genome and associate those changes with a human tumor. Studies like this allow models of tumor genesis to be developed, allowing an earlier prognosis regarding the development and cure of certain tumors. In this work, 30 metaphases were analyzed, both for SKY method and MCB. In the last one, the analysis was performed on each of the chromosomes. However, due to the poor quality of the results obtained and some inexperience of the operator, it was not possible to draw concrete conclusions regarding the chromosomal alterations that were found. It was only concluded that SEWA cells present an unstable karyotype, with several changes present in only one metaphase. Moreover, results between methods did not coincide, which led to the impossibility of creating a representative karyotype of the cell population and describing the breakpoints that would have meaning in homology with the human genome. It will then be necessary to re-evaluate the results so that new conclusions can be obtained